Патент на изобретение №2306567

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Способ предусматривает взаимодействие антител с антигеном, с антителами, мечеными пероксидазой хрена, добавление субстратной смеси и учет результатов реакции. При этом используют планшеты с предварительно сорбированными на них антителами и общий иммуноферментный конъюгат. Способ позволяет сократить время постановки диагноза и получать более достоверные результаты за счет повышения эффективности способа. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и вирусологии.

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к разработке способа дифференциальной диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

Ведущую роль в этиологии диарей у молодняка сельскохозяйственных животных играют рота-коронавирусы, вирус диареи – болезни слизистых, в меньшей степени другие инфекционные агенты. Указанные болезни широко распространены как в Российской Федерации, так и за рубежом, и наносят животноводческим хозяйствам ощутимый экономический ущерб, складывающийся из потерь от гибели, особенно в раннем возрасте, средств, затрачиваемых на лечение больных, и недополучении продукции от переболевших животных. Ежегодно половина потерь молодняка приходится на желудочно-кишечные заболевания в раннем возрасте.

С большой эффективностью решить проблему дифференциальной диагностики позволяет высокочувствительный метод иммуноферментного анализа.

В связи с вышеизложенным, проблема диагностики и борьбы с данными инфекциями является актуальной.

Известен способ диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа с использованием диагностического набора [1].

Также известен способ обнаружения антигена вируса диареи, для чего специфические иммуноглобулины, входящие в диагностический набор, вносят в лунки планшета по 0,1 мл и сорбируют на их поверхности. Раствор, содержащий исследуемый антиген, вносят в лунки по 0,1 мл и инкубируют с сенсибилизированными на поверхности носителя антителами в течение 1,5-2 ч при 37°С. Несвязавшийся антиген удаляют промыванием. Затем добавляют иммуноферментный конъюгат в объеме 0,1 мл. В положительных случаях конъюгат связывается с фиксированным на сенсибилизированной поверхности антигеном, образуя комплекс антитело-антиген-конъюгат. Избыток конъюгата удаляют промыванием и вносят в лунки субстратный индикаторный раствор, который меняет свою окраску по принципу окислительно-восстановительной реакции, пропорционально количеству конъюгированного с антителами фермента. Количество фермента пропорционально количеству антигена, фиксированного на сенсибилизированной поверхности лунок плашки [2].

В задачу наших исследований входило – разработать более достоверный способ дифференциальной диагностики рота-коронавирусных энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа со значительным сокращением времени на постановку диагноза.

Сущность предложенного способа состоит в следующем.

В лунки одного планшета с предварительно сорбированными антиротавирусными, антикоронавирусными, антидиарейными иммуноглобулинами автоматической пипеткой вносят испытуемую пробу по 0,10-0,12 мл в лунки с различными иммуноглобулинами, инкубируют 1,5-2 ч при температуре 37-38°С, планшет отмывают, вносят по 0,10-0,12 мл общий иммуноферментный конъюгат, состоящий из меченых ферментом антител к указанным возбудителям, инкубируют при тех же условиях, планшет отмывают и после добавления субстратной смеси проводят одновременный учет результатов реакции на рота-коронавирусный энтерит, вирусную диарею крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

Пример 1.

На первом этапе реакции во все лунки планшета автоматической пипеткой вносят по 0,1 мл фосфатно-буферного раствора. В первые лунки рядов с ротавирусными, коронавирусными, диарейными иммуноглобулинами вносят по 0,1 мл испытуемой пробы, пипетируют и по 0,1 мл переносят в следующую лунку и т.д. Для контроля реакции параллельно вносят по 0,1 мл специфических гомологичных антигенов и также титруют их как пробу. Таким же образом вносят отрицательный антиген. Планшет инкубируют в термостате 1,5-2 ч при 36-37°С, затем отмывают его от несвязавшихся антигенов. В отмытые лунки планшета вносят по 0,1 мл общий иммуноферментный конъюгат, состоящий из антиротавирусных, антикоронавирусных, антидиарейных иммуноглобулинов, меченых пероксидазой хрена. Планшет инкубируют в термостате при 36-37°С 1,5-2 ч и вновь трижды отмывают фосфатно-буферным раствором. Затем в лунки вносят по 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода. Результат реакции учитывают через 30-40 мин по изменению окраски образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета

– интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание – положительный результат;

– светло-коричневое окрашивание – сомнительный результат;

– окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля – отрицательный результат.

Предложенный способ, в отличие от известных, позволяет при проведении диагностики рота-коронавирусного энтерита, вирусной диареи крупного рогатого скота методом ИФА значительно сократить время на постановку реакции и получить более достоверные результаты при учете, так как исследования на эти инфекции осуществляются одновременно на одном планшете с предварительно сорбированными антиротавирусными, антикоронавирусными, антидиарейными иммуноглобулинами с использованием общего иммуноферментного конъюгата при одних и тех же условиях.

Предложенный способ для дифференциальной диагностики рота-коронавирусного энтерита, вирусной диареи КРС методом иммуноферментного анализа испытан комиссионно в октябре 2001 года и апробирован в некоторых ветеринарных лабораториях с положительным результатом.

На основании полученных в ходе проверки результатов комиссия сделала выводы о том, что набор является активным и специфичным и позволяет обнаруживать указанные специфические антигены в исследуемом материале в значительно более короткие сроки.

Предложенный способ найдет применение при обследовании крупного рогатого скота в неблагополучных по желудочно-кишечным инфекциям хозяйствах с целью диагностики рота-коронавирусных энтеритов, вирусной диареи КРС. Высокая чувствительность, специфичность, простота постановки реакции и возможность автоматизации процессов исследования позволяют в короткие сроки проводить массовые обследования животных с целью определения распространения этих инфекций.

Источники информации

1. Труды ВИЭВ, вып.60, М. 1984 г., с.63-66.

2. Доклады Россельхозакадемии с/х наук, М. 1998 г., вып.3, с.125.

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, преимущественно рота-коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота, включающий взаимодействие антител с антигеном, с антителами мечеными пероксидазой хрена, добавление субстратной смеси и учет результатов реакции по интенсивности окраски образовавшегося комплекса, отличающийся тем, что в реакции используют планшеты с предварительно сорбированными на них антиротавирусными, антикоронавирусными, антидиарейными антителами и после внесения испытуемых проб по 0,10-0,12 мл планшеты инкубируют, отмывают, далее вносят по 0,10-0,12 мл общий иммуноферментный конъюгат, состоящий из меченных ферментом антител к указанным возбудителям и далее проводят учет результатов.