Патент на изобретение №2306334
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) МЕЖВИДОВАЯ ЛИНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ОВЦЫ (Ovis aries) С ЛИМФОЦИТАМИ КРОЛИКА (ПО-TK–×ЛК) ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ – БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
(57) Реферат:
Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии. Штамм межвидовых гибридных клеток почки овцы с лимфоцитами кролика (ПО-ТК–×ЛК) получен путем слияния не размножающихся в культуре лимфоцитов кролика с перевиваемым мутантными клетками овцы ПО-ТК– методом многошаговой селекции. Штамм обладает высокой чувствительностью к вирусам инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи. Изобретение может быть использовано в вирусологических исследованиях для культивирования вирусов – диагностических исследований и в биотехнологии при производстве вакцин и диагностикумов. 1 табл.
Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к получению клеточных гибридов, используемых при вирусологических и биотехнологических исследованиях. Методы гибридизации соматических клеток в настоящее время широко применяются для решения многих проблем биологии, медицины и ветеринарии. Гибридные линии клеток используются при исследовании механизмов клеточной дифференцировки, взаимодействия ядра и цитоплазмы для изучения взаимодействия между вирусами и клетками хозяев. Известен штамм внутривидовых гибридных клеток почки овцы (OVIS ARIES) со спленоцитами овцы (ПО-ТК–×СО) для культивирования вирусов и агента скрепи. Морфологические признаки: межвидовой гибридный штамм представлен преимущественно клетками эпителиоподобного типа. Наряду с этим до 10-20% клеточной популяции составляют клетки лимфоидного типа, округлой формы, лежащие группами, с плотным ядром и узким ободком цитоплазмы. Пик митотической активности – 32-35%0, наблюдается через 72 часа культивирования; индекс пролиферации составил 3,2-4,2. Интервал изменчивости хромосом составил от 13 до 72 хромосом, модальный класс представлен 48 хромосомами. Культуральные свойства: межвидовой гибридный штамм культивируется в среде Игла MEM, Игла ДМЕМ с добавлением 4-5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов трипсина 0,25% и Версена 0,02% в соотношении 1:9, с коэффициентом пересева 1:4-1:5. Монослой формируется на 3-4 сутки при посевной концентрации 70-80 тыс. кл./мл. Криоконсервация штамма: криоконсервацию штамма осуществляют по 2-ступенчатому методу. Температуру снижают по 1-2°С в минуту до – 30°С, а далее до – 70°С по 3-5°С в минуту. По достижении температуры – 70°С ампулу с клетками помещают в жидкий азот. Криозащитную среду готовят по следующей прописи, %: ДМSO – 10 Сыворотка эмбрионов – 40-30 Среда Игла MEM – до 100 Гибридный штамм ПО ТК–×СО чувствителен к вирусу ринопневмонии лошадей, вирусу инфекционного ринотрахеита, латентному герпес-вирусу крупного рогатого скота (1). В задачу исследований входило – получить гибридный штамм лимфоцитов кролика, обладающий высокой чувствительностью к патогенным вирусам крупного рогатого скота. Предложенный штамм межвидовых гибридных клеток почки овцы с лимфоцитами кролика (ПО-ТК–×ЛК) получен путем слияния не размножающихся в культуре лимфоцитов кролика с перевиваемым мутантными клетками овцы ПО-ТК– методом многошаговой селекции. Штамм межвидовых гибридных клеток почки овцы (Ovis aries) с лимфоцитами кролика назван ПО-ТК–×ЛК депонирован 20 мая 2004 г. в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под №62. Предложенный штамм обладает следующими свойствами: Морфологические признаки: межвидовой гибридный штамм состоит из 2 популяций клеток: эпителиоподобных, напоминающих клетки исходной мутантной культуры, и лимфоцитоподобных, округлых с плотным ядром и узким ободком цитоплазмы, характерных для лимфоцитов. Полученная культура обладает высокой митотической активностью – 50-54%0, наблюдающейся на вторые сутки культивирования; индекс пролиферации составил 3,2-4,0. Число хромосом в метафазных пластинках составило от 88 до 120. Культуральные свойства: клетки активно растут и размножаются на синтетических питательных средах с добавлением сыворотки крупного рогатого скота. Межвидовой гибридный штамм культивируется в среде Игла MEM, Игла ДМЕМ с добавлением 4-5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов трипсина 0,25% и Версена 0,02% в соотношении 1:9, с коэффициентом пересева 1:4-1:5. Монослой формируется на 3-4 сутки при посевной концентрации 70-80 тыс. кл./мл. Криоконсервация штамма: криоконсервацию штамма осуществляют по 2-ступенчатому методу. Температуру снижают по 1-2°С в минуту до -30°С, а далее до -70°С по 3-5°С в минуту. По достижении температуры -70°С ампулу с клетками помещают в жидкий азот. Криозащитную среду готовят по следующей прописи, %: ДМSO – 10 Сыворотка эмбрионов – 40-30 Среда Игла MEM – до 100 Чувствительность к патогенным вирусам крупного рогатого скота отражена в таблице 1. Из приведенных примеров таблицы 1 видно, что новый межвидовой гибридный штамм ПО-ТК–×ЛК обладает более высокой чувствительностью к вирусам инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи – болезни слизистых крупного рогатого скота, чем исходная мутантная линия ПО-ТК– и внутривидовой гибрид почки и спленоцитов овцы ПО-ТК–×СО. Гибридный штамм ПО-ТК–×СО чувствителен к вирусам ринопневмонии лошадей, вирусу инфекционного ринотрахеита, латентному герпесу вируса крупного рогатого скота. Результаты исследований по чувствительности к вирусам клеток ПО-ТК–×ЛК коррелируют с ранее опубликованными данными по культивированию вируса ринопневмонии в гибридной культуре ПО ТК–×СО. Таким образом, предлагаемый штамм клеток ПО-ТК–×ЛК может служить в качестве резервного для выращивания вирусов. Предложенный штамм апробирован нами с положительным результатом в Лаборатории клеточной биотехнологии ВИЭВ с ноября 2002 года по октябрь 2004 года. Гибридный штамм ПО-TK–×ЛК найдет широкое применение в вирусологических исследованиях для культивирования вирусов – диагностических исследований при производстве вирус-вакцин и диагностикумов, например, для накопления вирусов инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, вирусной диареи крупного рогатого скота. Источники информации 1. Патент RU №2203318, С12N 5/06, 2003 г.
Формула изобретения
Линия межвидовых гибридных клеток почки овцы (Ovis aries) с лимфоцитами кролика (ПО-TK–×ЛК) депонирована в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) под №62 для культивирования вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи – болезни слизистых крупного рогатого скота.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||