Патент на изобретение №2306148

(54) ПЕПТИДЫ ЛАТАРЦИНЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ АНТИМИКРОБНУЮ АКТИВНОСТЬ

(57) Реферат:

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, и касается биологически активных пептидов, обладающих антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине. Изобретение решает задачу расширения ассортимента антимикробных пептидов с общей формулой (1) X₁-Lys-Leu-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-Arg-Lys-Ala-Ile-Ser-Tyr-Ala-Val-Lys-Lys-Ala-Х₇ (1), за счет модификации исходной структуры пептида латарцина, при этом в (1) X₁ отсутствует, или является остатком глицина (Gly), или дипептидом Phe-Gly, или трипептидом Leu-Phe-Gly, или тетрапептидом Gly-Leu-Phe-Gly; X₂ – остаток глутамина (Gln) или изолейцина (Ile); Х₃ – остаток аргинина (Arg) или лизина (Lys); X₄ – остаток аргинина (Arg) или лизина (Lys); X₅ – остаток лизина (Lys) или фенилаланина (Phe); Х₆ – остаток глицина (Gly) или лейцина (Leu); X₇ отсутствует, или является остатком аргинина (Arg), или дипептидом Arg-Gly, или трипептидом Arg-Gly-Lys, или тетрапептидом Arg-Gly-Lys-His, или тетрапептидом Arg-Gly-Lys-Asn. 4 табл., 3 ил.

Изобретение относится к биохимии, конкретно к биологически активным пептидам, обладающим антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине.

Особое место занимают антимикробные пептиды, не содержащие в своем составе остатков цистеина, поскольку такая структурная особенность значительно облегчает их производство химическим или биотехнологическим путем и снижает себестоимость. Много внимания уделяется линейным пептидам, склонных к организации в амфипатическую -спираль при контакте с мембранами, обсуждаются подходы к оптимизации их свойств с целью повышения терапевтического потенциала [Tossi A., Sandri L., Giangaspero A. Amphipathic,

В числе свойств, которые необходимо контролировать у потенциальных антибиотиков, – цитотоксическое действие на клетки макроорганизма, чаще оцениваемое в стандартных тестах на гемолитическую активность. Наличие подобной активности у целого ряда антимикробных пептидов является серьезным недостатком и ограничивает возможность их применения в качестве лекарственных средств.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента антимикробных пептидов.

Поставленная задача решается за счет структуры пептида латарцина, имеющего следующую аминокислотную последовательность:

X₁-Lys-Leu-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-Arg-Lys-Ala-Ile-Ser-Tyr-Ala-Val-Lys-Lys-Ala-X₇,

где X₁ отсутствует, или является остатком глицина (Gly), или дипептида Phe-Gly, или трипептида Leu-Phe-Gly, или тетрапептида Gly-Leu-Phe-Gly; X₂ – остаток глутамина (Gin) или изолейцина (Ile); Х₃ – остаток аргинина (Arg) или лизина (Lys); X₄ – остаток аргинина (Arg) или лизина (Lys); X₅ – остаток лизина (Lys) или фенилаланина (Phe); Х₆ – остаток глицина (Gly) или лейцина (Leu); X₇ отсутствует, или является остатком аргинина (Arg), или дипептида Arg-Gly, или трипептида Arg-Gly-Lys, или тетрапептида Arg-Gly-Lys-His, или тетрапептида Arg-Gly-Lys-Asn.

Заявляемые пептиды проявляют антимикробную активность в отношении ряда грамположительных (Arthrobacter globiformis, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus) и грамотрицательных (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) бактерий, а также дрожжевых грибов (Pichia pastoris). Для полного ингибирования роста перечисленных организмов in vitro необходимы микромолярные концентрации пептидов. При этом некоторые латарцины характеризуются низкой гемолитической активностью и низкой цитотоксичностью в отношении нормальных лейкоцитов (эффекты отсутствуют при концентрации пептидов 45 мкМ). Кроме того, в микромолярных концентрациях латарцины проявляют выраженный токсический эффект по отношению к клеткам эритролейкемии человека. Техническим результатом предлагаемого изобретения является высокая антимикробная активность заявляемых пептидов.

Заявляемые латарцины состоят из 22-26 аминокислотных остатков, т.е. являются сравнительно небольшими молекулами, что упрощает их получение химическим синтезом. Кроме того, пептиды являются линейными и не содержат остатков цистеина, что также упрощает их получение химическим синтезом или биотехнологически, поскольку исключает риск образования неактивных форм за счет некорректного замыкания дисульфидов.

Пептид латарцин-2а (LtAMP-2a) получают из природного источника – яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi Zonstein et Ovtchinnikov, 1999, который относится к семейству Zodariidae, отряду Araneae, классу Arachnida, типу Arthropoda.

Пептиды латарцины LtAMP-2a, LtAMP-2a_F10K, LtAMP-2a_I7Q, LtAMP-2a_QRR, LtAMP-2a_N1, LtAMP-2a_N2, LtAMP-2a_N3, LtAMP-2a_N4, LtAMP-2a_G11L, LtAMP-2_C4, LtAMP-2b (см. табл.1) получают химическим синтезом, они являются гомологами и демонстрирует сходные биологические свойства.

Заявляемые пептиды представляют собой новые соединения и не являются близкими гомологами других белков или пептидов.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Выделение антимикробного пептида латарцина-2а (LtAMP-2a) из яда паука Lachesana tarabaevi.

Цельный яд паука Lachesana tarabaevi подвергают разделению по методу ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Jupiter С₅ (2×150 мм, размер пор 300 Å, диаметр частиц 5 мкм, Phenomenex, США). Фракционирование проводят в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 0 до 60% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 60 минут со скоростью элюции 0,3 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм. Полученные фракции тестируют на способность ингибировать рост Escherichia coli. Пептид LtAMP-2a элюируется с колонки в составе фракции со временем удерживания 37 минут (фиг. 1).

Выделенную фракцию далее разделяют по методу ВЭЖХ на колонке Ascends RP-Amide (2,1×100 мм, диаметр частиц 3 мкм, Supeico, США). Фракционирование проводят в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 10 до 60% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 50 минут со скоростью элюции 0,3 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм. Полученные фракции тестируют на способность ингибировать рост Escherichia coli. Пептид LtAMP-2a элюируется с колонки со временем удерживания 29 минут (фиг. 2).

Содержание примесей в очищенной фракции, соответствующей LtAMP-2a, составляет 3%, что подтверждается разделением по методу ВЭЖХ на аналитической колонке Luna C₁₈ (1×150 мм, размер пор 100 Å, диаметр частиц 3 мкм, Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 20 до 50% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 40 минут со скоростью элюции 50 мкл/мин, детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм.

Пример 2.

Установление аминокислотной последовательности латарцина-2а.

Определение N-концевой аминокислотной последовательности очищенного пептида LtAMP-2a проводят методом ступенчатой деградации по Эдману на автоматическом секвенаторе Precise 492 (Applied Biosystems, США). В результате устанавливают полную аминокислотную последовательность латарцина-2а, состоящую из 26 аминокислотных остатков:

H₂N-Gly-Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-Ile-Lys-Lys-Phe-Gly-Arg-Lys-Ala-Ile-Ser-Tyr-Ala-Val-Lys-Lys-Ala-Arg-Gly-Lys-His

Пример 3.

Определение относительной молекулярной массы латарцинов.

Индивидуальность очищенных веществ подтверждают масс-спектрометрическим анализом. Масс-спектры получают на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре ultraflex II TOF/TOF (Bruker Daltonik, Германия), с идентификацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используют -циано-4-гидроксикоричную кислоту (10 мг/мл) в 50%-ном (v/v) ацетонитриле, содержащем 0,1%-ную (v/v) трифторуксусную кислоту. Для калибровки прибора используют стандартную смесь пептидов с диапазоном молекулярных масс 700-3500 Да (Sigma, США).

Измеренная моноизотопная молекулярная масса природного пептида LtAMP-2a составляет 2901,0 Да. Расчетная моноизотопная молекулярная масса пептида составляет 2900,8 Да, т.е. отличается от измеренной на 0,2 Да. Таким образом, латарцин-2а (LtAMP-2a) является линейным пептидом и не содержит каких-либо химических модификаций. Анализ аминокислотной последовательности латарцина-2а (распределение гидрофобных и гидрофильных остатков, общий заряд молекулы) позволяет предположить склонность этого пептида к образованию амфипатической -спирали при взаимодействии с мембранами.

Пример 4.

Химический синтез латарцинов.

Пептид LtAMP-2a синтезируют твердофазным методом путем наращивания цепи с С-концевого остатка на 2-хлор-тритил-хлоридной (с нагрузкой 0,8-1,44 ммоль/г) смоле (PepChem, Германия), для временной защиты -NH₂-групп используют флуоренилметоксикарбонильную группу (Fmoc) [Chan W.C., White P.D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. – 2000. – University Press, Oxford]. Защиту боковых групп аминокислотных остатков выбирают с расчетом на конечное деблокирование трифторуксусной кислотой: для защиты боковых групп остатков Ser и Туг используют третбутильную группу, для Lys – третбутилоксикарбонильную группу, для His – тритильную группу, для Arg – 2,2,4,6,7-пентаметилдегидробензофуран-5-сульфонильную группу.

Для присоединения первой (С-концевой) аминокислоты к смоле 1,5 экв (по отношению к количеству активных групп на смоле) Fmoc-защищенной аминокислоты растворяют в дихлорметане (из расчета 10 мл дихлорметана на 1 г смолы) с 1,5 экв диизопропилэтиламина. К полученному раствору добавляют еще 1,5 экв диизопропилэтиламина и приливают к сухой смоле, мягко перемешивают в течение 45 мин. Непрореагировавшие активные группы на смоле блокируют метанолом (из расчета 1 мл метанола на 1 г смолы) в течение 20 мин, после чего смолу промывают тремя объемами дихлорметана, тремя объемами N,N-диметилформамида и тремя объемами этанола, высушивают под вакуумом. Аминокислотные остатки присоединяют к пептидил-полимеру с образованием гидроксибензотриазолового эфира в присутствии 1,3-диизопропилкарбодиимида, для активации 1 экв аминокислоты используют 1,2 экв N-гидроксибензотриазола и 1 экв 1,3-диизопропилкарбодиимида. Для наращивания полипептидной цепи в ходе каждого синтетического цикла проводят конденсацию пептидил-полимера с 5 экв активированной Fmoc-аминокислоты (1-12 часов при 37°С), содержание непрореагировавших аминогрупп контролируют визуально по окрашиванию рН-зависимого индикатора бромфенолового синего.

Отщепление продукта от 2-хлор-тритил-хлоридного полимера с одновременным деблокированием боковых групп проводят смесью трифторуксусной кислоты, воды и этандитиола (95:2,5:2,5, v/v/v) из расчета 1 мл смеси на 50 мг смолы. Суспензию перемешивают в течение 2 часов, затем раствор пептида в трифторуксусной кислоте отфильтровывают от полимера. Продукт высаживают 10-кратным избытком (по объему) охлажденного диэтилового эфира, отфильтровывают, дважды промывают эфиром, после чего высушивают лиофильно.

Синтезированный пептид подвергают очистке по методу ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Luna C₁₈ (10×250 мм, размер пор 100 Å, диаметр частиц 10 мкм, Phenomenex, США). Фракционирование проводят в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 0 до 50% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 60 минут со скоростью элюции 2 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм.

Содержание примесей в синтетическом препарате LtAMP-2a составляет 1%, что подтверждается разделением по методу ВЭЖХ на аналитической колонке Luna C₁₈ (1×150 мм, размер пор 100 Å, диаметр частиц 3 мкм, Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 20 до 50% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 40 минут со скоростью элюции 50 мкл/мин, детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм.

Идентичность синтезированного LtAMP-2a природному доказывают при помощи масс-спектрометрического анализа, сравнением хроматографических подвижностей при разделении на аналитической колонке Luna C₁₈ (1×150 мм, Phenomenex, США), а также сравнением биологических свойств.

Пептиды LtAMP-2a_F10K, LtAMP-2a_I7Q, LtAMP-2a_QRR, LtAMP-2a_N1, LtAMP-2a_N2, LtAMP-2a_N3, LtAMP-2a_N4, LtAMP-2a_G11L, LtAMP-2_C4, LtAMP-2b синтезируют аналогичным способом, внося необходимые аминокислоты. Для защиты боковых цепей Asn, Gin используют тритильную группу.

Пример 5.

Антимикробные свойства латарцинов.

Для определения антимикробной активности фракций, полученных в ходе хроматографического разделения компонентов яда паука Lachesana tarabaevi, очищенного латарцина-2а, а также синтетических латарцинов. используют следующие штаммы микроорганизмов: Arthrobacler globiformis BKM Ac-1112, Bacillus subtilis BKM В-501, Escherichia coli C600, Escherichia coli DH5^th ed. – Williams and Wilkins, Baltimore. – 1996. – P.52-111].

Бактерии культивируют в жидкой низкосолевой среде LB (1% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, pH 7) при 37°С и перемешивании со скоростью 220 об/мин, дрожжи – в жидкой среде YPD (1% бакто-дрожжевой экстракт, 2% бакто-пептон, 2% глюкоза, pH 5,3) при 30°С и перемешивании со скоростью 150 об/мин в течение 18 ч. Полученные культуры разбавляют в 200 раз, используя те же среды, и выращивают в тех же условиях в течение 3-5 ч до достижения экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность культуры при 620 нм OD₆₂₀˜0,3-0,5), после чего снова разбавляют, используя исходные среды, до концентрации клеток 10⁵ колоний образующих единиц в 1 мл. Культуры помещают в стерильные 96-луночные планшеты, по 90 мкл в лунку, куда затем добавляют по 10 мкл растворов тестируемых веществ различных концентраций, получаемых серийными разведениями. Отрицательным контролем служит культура клеток с добавлением 10 мкл чистой воды, положительным – чистая среда для культивирования. Планшеты инкубируют в условиях, описанных выше, в течение 24 ч для бактериальных культур и 48 ч для дрожжевых, после чего измеряют OD₆₂₀, минимальные ингибирующие концентрации определяют как наименьшие концентрации веществ, полностью подавляющие рост микроорганизмов. Опыт проводят в трех независимых повторах.

Результаты определения минимальных ингибирующих концентраций для латарцина-2а представлены в таблице 2. Биологическая активность синтетического латарцина-2а идентична активности природного. Результаты для пептидов LtAMP-2a, LtAMP-2a_F10K, LtAMP-2a_I7Q, LtAMP-2a_QRR, LtAMP-2a_N1, LtAMP-2a_N2, LtAMP-2a_N3, LtAMP-2a_N4, LtAMP-2a_G11L, LtAMP-2_C4 представлены в таблице 3.

Таблица 2 Антимикробные свойства латарцина LtAMP-2a.
штамм	минимальная ингибирующая концентрация, мкМ
А. Грамотрицательные бактерии
Escherichia coli C600	3,0
Escherichia coli DH5	0,5
Escherichia coli MH1	0,7
Pseudomonas aeruginosa PAO1	6,7
Б. Грамположительные бактерии
Arthrobacter globiformis BKM Ac-1112	0,7
Bacillus subtilis BKM B-501	0,7
Staphylococcus aureus 209-P	1,5
В. Дрожжевые грибы
Pichia pastoris GS 115	6,7

Пример 6.

Тестирование латарцинов на гемолитическую активность.

Гемолитическую активность пептидов определяют с использованием крови здорового донора (группа В, Rh+). К 100 мкл свежей крови добавляют 900 мкл среды RPM1-1640, содержащей 2 мМ L-глутамин, 8% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС) и гепарин (10 ед/мл). Определяют плотность клеток, после чего суспензию разводят средой RPM1-1640 до плотности 10⁷ клеток/мл. К полученной суспензии добавляют тестируемый пептид нужной концентрации, в качестве отрицательного контроля используют клетки без добавления пептида. Инкубируют при 37°С и перемешивании со скоростью 120 об/мин в течение 3 ч, после чего клетки осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 4000 g. 100 мкл супернатанта отбирают в стерильные 96-луночные планшеты, выход гемоглобина из эритроцитов оценивают по оптической плотности при 414 нм. Гемолитическая активность пептидов (см. табл. 4) выражается в % от максимально возможного гемолиза, максимально возможный лизис эритроцитов (положительный контроль) получают за счет ресуспендирования осажденных клеток в чистой воде до плотности 10⁷ клеток/мл.

Таблица 4 Цитотоксические свойства латарцинов.
пептид	эритроциты человека	нормальные лейкоциты человека	клетки эритролейкемии человека К562
	ЭК50 , мкМ	ИК50 , мкМ	ИК50 , мкМ
LtAMP-2a	9,2	17,9	3,3
LtAMP-2a_F10K	–	–	18,6
LtAMP-2a_I7Q	–	–	24,7
LtAMP-2a_QRR	–	–	16,9
LtAMP-2a_N1	9,0	19,9	3,2
LtAMP-2a_N2	55	ИК20=43#	10,7
LtAMP-2a_N3	–	–	ИК20=44#
LtAMP-2a_N4	–	–	–
LtAMP-2a_G11L	5,2	2,7	1,0
LtAMP-2_C4	58	51	58
– эффективная концентрация, вызывающая 50% лизис – активность отсутствует при концентрациях до 45 мкМ # – эффективная концентрация, вызывающая 20% лизис

Пример 7.

Тестирование латарцинов на цитотоксичность по отношению к лейкоцитам и клеткам эритролейкемии человека.

Оценку цитотоксических свойств латарцинов для лейкоцитов человека проводят на фракции крови здорового донора (группа В, Rh+), обогащенной лейкоцитами, которую получают отстаиванием гепаринизированной (10 ед/мл) крови в течение 2 ч при 15°С в темноте. Отбирают фракцию выше эритроцитарного столба, соотношение лейкоцитов и эритроцитов в которой 1:10, добавляют 1,5 объема среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамин и 8% ЭБС. Клетки осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 200 g, супернатант удаляют, клетки ресуспендируют в равном объеме среды RPMI-1640. Операцию повторяют дважды, после чего клетки рассаживают в 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты (10⁶ клеток/мл, 150 мкл среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-Gln и 8% ЭБС, на лунку).

Клетки эритролейкемии человека К562 культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 8% ЭБС при 37°С, в атмосфере 100%-ной влажности с 5%-ным содержанием CO₂. За день до эксперимента клетки рассаживают в 96-луночные планшеты (10⁶ клеток/мл).

В лунки вносят исследуемые пептиды в нужной концентрации, в качестве отрицательного контроля в лунки добавляют чистую воду. Клетки (К562 и лейкоциты) инкубируют с различными концентрациями пептидов в течение 3 ч при 37°С, затем в лунки вносят флуоресцентные красители Hoechst33342 (20 мкМ, окрашивает ядра всех клеток) и пропидиум иодид (20 мкМ, окрашивает ядра мертвых клеток) и через 15 мин регистрируют флуоресцентные изображения клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M (Zeiss, Германия) с цифровой камерой AxioCam MRc (Zeiss, Германия) в области флуоресценции Hoechst33342 (фильтры на возбуждение – ВР 365/12, на эмиссию – LP 397) и в области флуоресценции пропидиум иодида (фильтры на возбуждение – ВР 510-560, на эмиссию – LP 590). По этим изображениям для каждой концентрации пептида подсчитывают общее число клеток (1000 клеток на одно измерение) и число мертвых клеток среди них, а затем рассчитывают концентрацию пептида, вызывающую гибель 50% клеток, ИК₅₀. Результаты (см. табл.4, фиг.3) усредняют по трем независимым экспериментам.

Формула изобретения

Пептид латарцин, проявляющий антимикробную активность, имеющий следующую аминокислотную последовательность:

X₁-Lys-Leu-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-Arg-Lys-Ala-Ile-Ser-Tyr-Ala-Val-Lys-Lys-Ala-X₇,

где X₁ отсутствует или является остатком глицина (Gly), или дипептидом Phe-Gly, или трипептидом Leu-Phe-Gly, или тетрапептидом Gly-Leu-Phe-Gly; Х₂ – остаток глутамина (Gln) или изолейцина (Ile); Х₃ – остаток аргинина (Arg) или лизина (Lys); X₄ – остаток аргинина (Arg) или лизина (Lys); Х₅ – остаток лизина (Lys) или фенилаланина (Phe); Х₆ – остаток глицина (Gly) или лейцина (Leu); X₇ отсутствует или является остатком аргинина (Arg), или дипептидом Arg-Gly, или трипептидом Arg-Gly-Lys, или тетрапептидом Arg-Gly-Lys-His, или тетрапептидом Arg-Gly-Lys-Asn.

РИСУНКИ