Патент на изобретение №2305845
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АКТИВНОСТИ ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПНЕВМОНИИ У ДЕТЕЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, а именно к способу определения активности воспалительного процесса непосредственно в пораженном легком у детей с хронической пневмонией. Сущность способа: в сыворотке крови определяют содержание метаболитов оксида азота, затем по формуле уi=0,34хi+5,4 рассчитывают содержание метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. При увеличении концентраций метаболитов оксида азота в сыворотке крови более чем в 1,6 раза, а в жидкости бронхоальвеолярного лаважа более чем в 1,3 раза по сравнению с нормой у детей диагностируют высокую активность воспалительного процесса. Применение способа позволяет с высокой точностью выявлять локальные концентрации метаболитов оксида азота в бронхоальвеолярном пространстве при различных формах хронической пневмонии без проведения травматичной диагностической процедуры трахеобронхоскопии. 2 табл.
(56) (продолжение): CLASS=”b560m”sputum versus blood. J. Korean. Med. Sci. 2003, Aug; 18(4), p.489-493, реф. Найдено из БД PubMed, PMID: 12923323. [Найдено 20.08.2006]. [он-лайн]. BERRY M. Alveolar nitric oxide in adults with asthma: evidence of distal lung inflammation in refractory asthma. Eur., Respir J. 2005 Jun; 25(6), p.986-991, реф. Найдено из БД PubMed, PMID: 15929952. [Найдено 26.08.2006]. [он-лайн].
Изобретение относится к медицине, а именно к методам определения активности воспаления при различных формах хронической пневмонии у детей. Хронические пневмонии у детей нередко протекают без выраженных клинических проявлений, что требует точного определения активности воспаления, так как это необходимо для дифференциальной диагностики, оценки эффективности и качества проводимой терапии (Каганов С.Ю., Розинова Н.Н., Голикова Т.М. и др. Хронические заболевания легких у детей и критерии их диагностики. – М., 1979. – 248 с.; Балаболкин И.И. Бронхиальная астма у детей. – М.: Медицина, 2003. – 320 с.). Известен способ диагностики активности воспаления в легких путем рентгеновских исследований (рентгеноскопия, рентгенография, томография), позволяющий установить характер и распространенность воспалительных изменений в паренхиме легких и бронхах (Бакланова В.Ф., Васильев Ю.Д., Ватолин К.В., и др. Рентгенодиагностика в педиатрии: Руководство для врачей в 2-х томах. – М.: Медицина, 1988, т.1. C.164-302). Недостатками способа являются значительная лучевая нагрузка на детский организм и, в ряде случаев, травматичность. Поэтому применение этих исследований в педиатрии должно быть ограничено. Следует учитывать, что лучевые способы диагностики позволяют выявлять уже сформированные воспалительные изменения, когда в результате активного воспаления уже произошло патологическое ремоделирование легочной ткани. Кроме того, недостатком рентгеновских способов диагностики хронических пневмоний у детей является значительная доля субъективизма при интерпретации полученных данных. Известен способ диагностики активности воспаления в легких путем трахеобронхоскопии (Климанская Е.В. Основы детской бронхологии. – М., 1972. – 176 с.). Способ позволяет восстанавливать проходимость дыхательных путей, получать содержимое бронхов и эндобронхиально вводить лекарственные препараты. Недостатком этого способа являются травматичность и необходимость проведения процедуры у детей только под общим обезболиванием. Способ не дает представления о состоянии и воспалительных изменениях легочной ткани. Кроме того, для выполнения способа необходим комплекс дорогостоящего бронхологического и анестезиологического оборудования и специально обученный персонал (Филиппов В.П., Ловачева О.В. Диагностический бронхоальвеолярный лаваж. – М., 1988. – С.5-16). Одним из современных методов оценки активности воспаления при хронических формах бронхолегочной патологии является количественное определение биологически активных соединений в качестве маркеров воспаления, которые могут использоваться как при оценке степени обострения, так и эффективности терапии этих заболеваний у детей. Известен способ оценки активности воспаления в дыхательных путях путем определения метаболитов оксида азота (NO) в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом, выбранный нами за прототип (Невзорова В.А., Лукьянов П.А., Кулакова Н.В., Гельцер Б.И. Способ оценки активности и характера воспаления дыхательных путей: Патент RU 2152617 С1 от 07.10.2000). Способ осуществлялся следующим образом: у больных обоего пола в возрасте 20-60 лет проводили трахеобронхоскопию и субсегментарный бронхоальвеолярный лаваж по методике, описанной Г.И.Лукомским и соавт.(Лукомский Г.И., Шулутко М.В., Виннер М.Г. Бронхопульмонология. – М.: Медицина, 1982. – 400 с.). Жидкость бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) получали в объеме 25 мл. Аликвоту ЖБАЛ, содержащую в своем составе 10 частей 2% раствора ЭДТА, центрифугировали, исследования проводили с бесклеточными фракциями ЖБАЛ. В ЖБАЛ больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом определяли сумму метаболитов оксида азота – NO2 – и NO3 –. Так как NO2 – является неустойчивым анионом и при воздействии окислителей легко доокисляется до NO3 – Для определения NO2 – и NO3 – к 1 мл супернатанта в пробирку добавляли 0,3 г кадмиевой пыли, импрегнированной медью, и нагревали на водяной бане 60 мин при температуре 100°С. При охлаждении пробу центрифугировали 3 мин при 12000 об/мин. Полученный супернатант использовали для определения суммы метаболитов NO. К 100 мкл пробы супернатанта в пластиковом планшете добавляли 50 мкл 5% раствора NH4Cl, 50 мкл 2% раствора сульфаниламида в воде и 50 мкл 0,2% раствора нафтилэтилендиамина в 5% растворе Н3PO4. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре Dynatech при 540 нм. Количество NO2 – и НО3 – выражали в нмоль/мл или в нмоль/мг белка ЖБАЛ. Недостатками этого способа является обязательное проведение эндоскопического исследования (трахеобронхоскопии и субсегментарного бронхоальвеолярного лаважа), которые у детей проводятся под наркозом, что делает способ травматичным и опасным для здоровья. Кроме того, этот способ является сложным при заборе образцов, требует использования дорогостоящего стационарного эндоскопического оборудования, практически не выполним у детей раннего и дошкольного возраста, не обеспечивает возможностей для выполнения отсроченного анализа и проведение исследований в малых клиниках скорой помощи и в условиях районных больниц. Задачей настоящего изобретения является разработка нового точного неинвазивного способа диагностики активности воспаления при хронической пневмонии у детей непосредственно в пораженном легком без использования травматичных бронхоскопических методов. Поставленная задача решается путем количественного определения содержания метаболитов оксида азота в биологическом материале у детей, при этом в качестве биологического материала используют сыворотку крови, в которой определяют концентрацию метаболитов оксида азота (хi) и по формуле yi=034xi+5,4 расчитывают содержание метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и при увеличении концентраций метаболитов оксида азота в сыворотке крови более чем в 1,6 раза, а в жидкости бронхоальвеолярного лаважа более чем в 1,3 раза по сравнению с нормой диагностируют высокую активность воспалительного процесса, при этом в качестве нормы принимают концентрацию метаболитов оксида азота в сыворотке крови 23,57±2,35 мкМ/л и 15,69±2,60 мкМ/л в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Сущность заявляемого изобретения заключается в прямом аналитическом определении содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови у детей, больных хроническими пневмониями, на основании чего рассчитывают концентрации метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) по уравнению регрессии:
где: yi и xi – коррелируемые (сопоставляемые) величины (содержание метаболитов NO в ЖБАЛ и сыворотке крови конкретных больных), xср, yср – средняя арифметическая ряда х (значения концентраций метаболитов NO в сыворотке крови) и ряда у (значения концентраций метаболитов NO в ЖБАЛ), Ry/x – расчетный коэффициент линейной регрессии, который определяют при линейной корреляции по формуле: ry/х – коэфффициент линейной корреляции,
Числовые значения xср, yср, Ry/x, ry/х, С помощью этого уравнения с высокой достоверностью можно рассчитать концентрации метаболитов оксида азота в ЖБАЛ по значениям содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови каждого конкретного больного с пневмонией без проведения трахеобронхоскопии и субсегментарного бронхоальвеолярного лаважа. Способ осуществляется следующим образом. Забор проб крови проводится у детей в условиях физиологического покоя утром, натощак, из локтевой вены не ранее чем через час после сна в пластиковые пробирки. После 30 мин экспозиции кровь 20 минут центрифугируют при 4°С – 2000 g. Полученную сыворотку крови можно хранить до следующего этапа исследования при -20°С. Для осаждения белка к 1 мл сыворотки крови добавляют 100 Нами было обследовано 125 детей в возрасте 3-17 лет. Из них было 84 ребенка, больных хронической пневмонией с длительностью заболевания – от 1 года до 12 лет. Исследование содержания метаболитов NO в сыворотке крови проводилось также у 18 практически здоровых детей, составивших контрольную (референтную) группу. Контрольную группу при исследовании NO в лаважной жидкости составили 23 больных хронической пневмонией с односторонним процессом, у которых был взят секрет из бронхов сохранного легкого. Для определения объема и локализации воспаления было проведено рентгено-бронхологическое обследование. У всех больных был проведен анализ газового состава и кислотно-основного состояния крови, а у детей старше 5 лет были исследованы функции внешнего дыхания с определением статических и динамических легочных объемов. Эти данные позволили документировать стадии обострения и стадии ремиссии хронической пневмонии у детей. Проведенные исследования показали, что существует тесная прямая корреляция между содержанием метаболитов оксида азота в сыворотке крови и в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у всех исследованных нами больных хронической пневмонией – коэффициент корреляции r=0,9 (р<0,01). На этом основании можно количественно определить концентрации оксида азота в лаважной жидкости (y) в зависимости от его содержания в сыворотке крови (x). Для проведения расчетов используются следующие параметры: yi и xi – коррелируемые (сопоставляемые) величины, обозначающие соответственно содержание метаболитов NO в ЖБАЛ и сыворотке крови конкретных больных), xср, yср – средние арифметические ряда x и ряда y (средние значения концентраций метаболитов NO в сыворотке крови и в ЖБАЛ всех больных), Ry/x – расчетный коэффициент линейной регрессии, который определяют при линейной корреляции по формуле: ry/x – коэфффициент линейной корреляции,
Числовые значения коэффициентов линейной регрессии, линейной корреляции, средних квадратических отклонений устанавливаются по данным обследования разных групп больных и группируются в соответствии со стандартными статистическими методами (См. 7.2.2. – Метод группировок. – С.190-197, а также 7.4.1. – Линейный коэффициент корреляции. – С.206-213. В кн.: Теория статистики: Учебник / Под ред. проф. Г.Л.Громыко. – М.: Инфра-М, 2002.). В результате расчетов для обследованных больных с хронической пневмонией нами получено значение xcp=37,26, (xcp – средняя арифметическая из всех значений (обследуемой группы) концентраций метаболитов NO в сыворотке крови), yср=18,07, (ycp – средняя арифметическая из всех значений (обследуемой группы) концентраций метаболитов NO в ЖБАЛ).
Рассчитанные значения: ry/x (коэффициент корреляции)=0,8;
В результате преобразуем уравнение
Отсюда Таким образом, уравнение преобразовано и в окончательном виде представляет собой удобную форму для расчетов: Подставляя в это уравнение значение концентрации NO в сыворотке крови больного (хi), вычисляем концентрацию метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (yi) данного больного. Используя фактические данные наших исследований содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови в группе больных с хронической пневмонией по уравнению Достоверность регрессии Ry/x в примере составила р<0,01.
Полученные по расчету значения содержания метаболитов оксида азота в лаважной жидкости y (при заданных значениях NO в сыворотке крови x) сравнили с фактическими значениями концентраций метаболитов оксида азота (табл.2). Как показано в таблице 2, рассчитанные значения содержания метаболитов NO в ЖБАЛ существенно не отличаются от имеющихся фактических данных.
Для оценки величин, составляющих ряд регрессии (столбец 3, т.е. значения, вычисленные по формуле), применяется среднее квадратическое отклонение регрессии Зная вычисленные средние значения концентраций(столбец 3) метаболитов NO в ЖБАЛ, определяем и их колебания в пределах, в которых могут находиться индивидуальные значения метаболитов NO в ЖБАЛ: 18,12±2,37 19,80±2,37 17,60±2,37 10,23±2,37 24,00±2,37 Определив среднюю ошибку коэффициента регрессии (mRy/х) и оценив полученные выборочные коэффициенты регрессии с помощью критерия t (t=Ry/x/mRy/x), получили степень достоверности коэффициентов регрессии, в нашем случае р<0,01. Таким образом, предлагаемый способ позволяет рассчитывать концентрации метаболитов оксида азота в лаважной жидкости без проведения бронхоскопического исследования, что позволяет точно определять локальную активность воспалительного процесса (по существу в зоне воспаления) и применять данный способ для диагностики и оценки эффективности лечения хронической пневмонии у детей. Проведенные нами исследования указывают на то, что оксид азота, как в сыворотке крови, так и в жидкости бронхоальвеолярного лаважа является диагностическим критерием степени активности воспаления при различных формах хронической пневмонии у детей. Определение содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови является простым, щадящим и точным методом исследования по сравнению с комплексом эндоскопических процедур получения жидкости бронхоальвеолярного лаважа и определением в ней метаболитов оксида азота. Благодаря этому расчету диагностический алгоритм упрощается – первым шагом является аналитическое определение содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови больного, а затем производится расчет концентрации метаболитов оксида азота в ЖБАЛ предложенным нами способом по формуле Было получено, что повышение концентрации метаболитов оксида азота в сыворотке крови более чем в 1,6 раза, а в жидкости бронхоальвеолярного лаважа более чем в 1,3 раза по сравнению с нормой свидетельствует о высокой активности воспалительного процесса у детей с хронической пневмонией. При этом в качестве нормы следует использовать значения концентраций метаболитов оксида азота 23,57±2,35 мкМ/л в сыворотке крови и 15,69±2,60 мкМ/л в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Примеры конкретного осуществления способа. Пример 1. Лена Г., 14 лет (История болезни 6012/01) поступила в пульмонологическое отделение с диагнозом: Хроническая двусторонняя пневмония: пневмосклероз, деформация бронхов левой верхней доли и бронхов левой нижней доли. Нижнедолевой катарально-гнойный эндобронхит. С 7 летнего возраста отмечались частые бронхиты, протекающие с обструктивным синдромом. Назначаемая антибактериальная и муколитическая терапия существенного эффекта не имели; сохранялся кашель с гнойной мокротой. При аускультации легких хрипы не выслушиваются. На рентгенограмме органов грудной клетки: выраженная деформация легочного рисунка нижних долей легких. Снижение перфузии верхних долей легких. Расширение корней обоих легких. При проведении трахеобронхоскопии выявлен двусторонний нижнедолевой гнойный эндобронхит. Уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови составил 73,40 мкМ/л, в лаважной жидкости – 27,76 мкМ/л; содержание метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, рассчитанное по формуле, – 30,35 мкМ/л. Заключение: у обследованной больной выявлено превышение нормы содержания метаболитов оксида азота в крови более чем в 3,0 раза и в жидкости бронхоальвеолярного лаважа – в 1,8 раза, что указывает на очень высокую активность воспалительного процесса в обоих легких. Причем расчетное значение концентраций метаболитов оксида азота также превышало их нормальные уровни в 1,9 раза. Эти лабораторные показатели адекватно соответствовали тяжелой клинической картине обострения хронической двусторонней пневмонии у больного ребенка, что потребовало назначения комплексной терапии – антибактериальной, муколитической, бронхолитической и симптоматической. Пример 2. Анна О., 14 лет (История болезни 2459/01) поступила в пульмонологическое отделение с диагнозом: Хроническая левосторонняя пневмония. Пневмосклероз базальных и язычковых сегментов левого легкого. Деформация и расширение бронхов С 4, 5, 8, 9, 10. Левосторонний гнойно-катаральный эндобронхит. С 3-х лет часто болела респираторными вирусными инфекциями, бронхитами. При поступлении: жалобы на кашель с выделением слизисто-гнойной мокроты. При аускультации слева при форсированном дыхании выслушиваются сухие и влажные среднепузырчатые хрипы. Рентгенография грудной клетки: усиление и деформация легочного рисунка в базальных и язычковых сегментах левого легкого. Корни легких структурно изменены. Трахеобронхоскопия: левосторонний катарально-гнойный эндобронхит. Уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови составил 46,75 мкМ/л, в лаважной жидкости – 21,56 мкМ/л; значения, рассчитанные по формуле, – 21,30 мкМ/л. Заключение: у обследованной больной выявлено превышение нормы содержания метаболитов оксида азота в крови более чем в 1,9 раза, в жидкости бронхоалъвеолярного лаважа – в 1,4 раза, а расчетные значения концентраций метаболитов оксида азота в лаважной жидкости превышали референтный уровень более чем в 1,3 раза, что указывает на высокую активность воспалительного процесса в обоих легких. Это заключение было подтверждено дальнейшим клиническим наблюдением и тяжелым течением хронической пневмонии у этой больной, что потребовало назначения эффективной антибактериальной и муколитической терапии. Пример 3. Алексей Ш., 12 лет (История болезни 764/01) находился на лечении с диагнозом: правосторонняя нижнедолевая хроническая пневмония, деформирующий бронхит сегментов 7-10 правого легкого. Бронхообструктивный синдром. В легких выслушивается ослабленное дыхание, единичные сухие хрипы справа. Флоуметрия: умеренно выраженные нарушения проходимости периферических бронхов. Рентгенограмма органов грудной клетки: очаговых и плевральных изменений нет. Трахеобронхоскопия: правосторонний катаральный эндобронхит в фазе стихания. При обострении бронхолегочного процесса получал антибактериальную и муколитическую терапию. Уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови составил 24,92 мкМ/л, в лаважной жидкости – 13,68 мкМ/л; значения, рассчитанные по формуле, – 13,87 мкМ/л. Заключение: у обследованного больного не выявлено значимого увеличения содержания метаболитов оксида азота в крови и в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, при этом расчетные концентрации метаболитов оксида не отличались от аналитически установленных, что указывает на отсутствие воспаления в бронхолегочной системе данного больного, подтверждено клиническим наблюдением и свидетельствует также об эффективности проведенной комплексной терапии. Таким образом, конкрентые клинические примеры и опыт использования предлагаемого способа для диагностики активности воспаления при хронической пневмонии у детей свидетельствует об адекватности результатов, получаемых заявленным способом, не только аналитически установленным данным, но и клинической картине течения хронической пневмонии у обследованных больных, а именно измеренные аналитически концентрации метаболитов оксида азота в крови и в жидкости бронхоальвеолярного лаважа соответствуют расчетным значениям содержания метаболитов оксида азота в лаважной жидкости, указывают на активность воспалительного процесса и подтверждаются дальнейшим клиническим наблюдением за больными детьми. Этот способ диагностики активности воспаления при хронической пневмонии у детей непосредственно в пораженном легком без использования травматичных бронхоскопических методик является достоверным, точным и неинвазивным.
Формула изобретения
Способ диагностики активности воспаления при хронической пневмонии путем количественного определения содержания метаболитов оксида азота в биологическом материале, отличающийся тем, что у детей в качестве биологического материала используют сыворотку крови, в которой определяют концентрацию метаболитов оксида азота (xi) и по формуле уi=0,34хi+5,4 рассчитывают содержание метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и при увеличении концентраций метаболитов оксида азота в сыворотке крови более чем в 1,6 раза, а в жидкости бронхоальвеолярного лаважа более чем в 1,3 раза по сравнению с нормой диагностируют высокую активность воспалительного процесса, при этом в качестве нормы принимают концентрацию метаболитов оксида азота в сыворотке крови 23,57±2,35 мкМ/л и 15,69±2,60 мкМ/л в жидкости бронхоальвеолярного лаважа.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
,
y, 
л 35% сульфосалициловой кислоты. Пробы тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Затем пробы центрифугируют при 5000 g 15 минут для полного осаждения белка. Супернатант после доведения рН 10 
-нафтиламин). В результате этой реакции образуется окрашенное в красный цвет азотсодержащее соединение в концентрации, пропорциональной содержанию нитрата натрия в анализируемом растворе. Измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 520 нм и рассчитывают концентрацию нитрита (NO2) по градуировочному графику, построенному по шести известным концентрациям NaNO3.
, были сделаны следующие расчеты (табл.1).
1-r2 xy), составляющее в нашем случае