Патент на изобретение №2305842

(54) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИОННЫЙ ТЕСТ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Тест-система основана на реакции пассивной гемагглютинации для выявления специфических противотрепонемных антител к Treponema pallidum и включает формализированные куриные эритроциты, сенсибилизированные рекомбинантным антигеном TmpA и 5% раствор бромфенолового синего. Изобретение позволяет выявить специфические антитела к Treponema pallidum в сыворотке крови и ликворе и визуально оценить все внесенные в тест-систему компоненты и образцы. 5 табл.

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии.

Использование: выявление специфических антител к Treponema pallidum.

Сущность: получение теста на основе реакции пассивной гемагглютинации с использованием рекомбинантного антигена TmpA для выявления специфических антител к Treponema pallidum.

Сифилис – хроническое инфекционное заболевание с разнообразными клиническими проявлениями, протекающее в несколько стадий. По оценкам ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется 12 млн. новых случаев заболевания, причем более 90% приходится на развивающиеся страны. В России последнее десятилетие XX века охарактеризовалось вспышкой заболеваемости сифилиса с максимумом в 1997 году (277 случаев на 100 тыс. населения). Несмотря на наметившуюся в последние годы тенденцию к снижению заболеваемости сифилисом, среднероссийский показатель заболеваемости еще слишком высок (95,5 случаев на 100 тыс. населения в 2003 году).

Поскольку возбудитель сифилиса – патогенная Treponema pallidum не культивируется на питательных средах in vitro и окраска ее простыми лабораторными методами затруднена, разработан ряд методов для идентификации инфекционного процесса на разных его стадиях. Преобладание скрытых форм сифилиса, патоморфоз клинических проявлений, малосимптомное течение заболевания обуславливают настоятельную необходимость применения для постановки диагноза высокочувствительных, высокоспецифичных и одновременно простых, дающих быстрый ответ методов серодиагностики. Всеми этими качествами обладает реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РПГА).

Метод РПГА основан на агглютинации эритроцитов животных, сенсибилизированных антигенами патогенных бледных трепонем штамма Николс или культуральных бледных трепонем, при наличии в исследуемой сыворотке специфических противотрепонемных антител. Реакции, основанные на гемагглютинации, легко выполняются, не требуют специального оборудования и высокой профессиональной подготовки персонала. В соответствии с Приказом №87 Минздрава РФ от 26.03.2001 г. РПГА относится к диагностическим подтверждающим тестам, при этом в связи с простотой постановки и наличием коммерческих тест-систем РПГА может быть и высокоэффективным отборочным (скрининговым) тестом. Существует микро- и макромодификации постановки РПГА, чаще используется первая из-за экономичности, быстроты постановки и учета результатов. Кроме того, есть качественный и количественный варианты постановки. Последний вариант позволяет определять титры антител в сыворотке крови. В количественном варианте РПГА нашла применение в оценке динамических изменений в содержании антител при специфической терапии.

Используемые в настоящее время в РПГА антигены являются ультросоникатом патогенных трепонем, полученных при заражении экспериментальных животных, либо ультросоникатом культуральных непатогенных трепонем (Т. phagedenis subs. Reiter, T. pallidum VIII шт.), которые различаются по антигенному составу.

Известен диагностический набор «Syphilis TPHA Fest liquid» (Human, Германия), в котором птичьи эритроциты сенсибилизированы ультросоникатом Т. pallidum. В присутствии специфических антител к Т. pallidum эритроциты слипаются, что ведет к появлению характерной картины в лунках планшета. Растворы не окрашены.

Известен диагностический набор «Люис РПГА тест» (Ниармедик плюс, Россия), в котором антигены Treponema pallidum (патогенный штамм Николе) адсорбированы на птичьих эритроцитах (Временная фармакопейная статья ВФС 42-3217-98, утверждена приказом Минздрава России от 17.12.98 №367, регистрационный №98/367/10, Инструкция по применению утверждена 23.10.1998 г.). Растворы не окрашены.

Мембранные и трансмембранные антигены Т. pallidum являются липопротеинами. Липидные компоненты трепонемных антигенов, по-видимому, усиливают иммунологическую реакцию, но могут обуславливать неспецифические реакции. Применение рекомбинантных белков позволяет избежать неспецифической гипердиагностики. Использование рекомбинантных белков также служит потенциалом для повышения чувствительности тестов, так как рекомбинантные антигены являются аналогами иммунодоминантных белков Treponema pallidum. В настоящее время рекомбинантные антигены широко применяются в различных методах в серодиагностике сифилиса (ИФА, иммуноблотинг).

Рекомбинантные антигены используются также в диагностическом тесте «Syphilis Fast» (Diesse, Monteriggioni, Italy) на основе реакции агглютинации латекса. Принцип реакции заключается во взаимодействии противотрепонемных антител с антигенами Т. pallidum, находящимися на поверхности латексных частиц, результатом чего является агглютинация последних. В тесте «Syphilis Fast» на латексных частицах сорбированы рекомбинантные антигены – аналоги белков Т. pallidum с молекулярными массами 15, 17 и 47 кДа.

Например, способ обнаружения противотрепонемных антител с указанными рекомбинантными антигенами, в том числе реакцией агглютинации, описан в патенте ЕР 0670494, опубл. 1995-09-06.

В Методических указаниях «Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис», утвержденных Приказом Минздрава РФ №87 от 26.03.2001 г. отмечено, что чувствительность РПГА при серодиагностике сифилиса составляет 99,4%. Специфичность РПГА в исследованиях с использованием сывороток доноров близка к 100%, в то время как для случайной выборки пациентов она составляет 95,4%. Если при вторичном, скрытом и позднем сифилисе чувствительность РПГА приближается к 100%, то при первичном сифилисе РПГА становится положительной немного позже реакции иммунофлюоресценции (РИФ), иммуноферментного анализа (ИФА) и RPR теста. Чувствительность РПГА при первичном сифилисе около 76%. В иммуноферментных тест-системах, иммуноблотинге, в латексном тесте «Syphilis Fast», использующих рекомбинантные антигены, чувствительность при первичном сифилисе составляет 95-100%. Потенциалом повышения чувствительности тестов на основе РПГА является использование рекомбинантных антигенов.

Например, Int. J. STD AIDS. 1998 Apr; 9(4):196-200. Young H.A, New recombinant antigen latex agglutination test (Syphilis Fast) for the rapid serological diagnosis of syphilis раскрывает возможность использования рекомбинантых белков TpN15, TpN17 and TpN47 для диагностики сифилиса методом гемагглютинации.

Широко используемым в серодиагностике сифилиса, иммунодоминантным антигеном является трансмембранный белок TpN 41-44,5. Белок 41-44,5 KDa с помощью моноклональных антител был идентифицирован как TmpA липопротеин.

Описан рекомбинантный белок Т. pallidum TmpA для использования в качестве иммуносорбента в иммуноферментной тест-системе для серодиагностики сифилиса, например в статье: С.В.Серегин и др., Получение рекомбинантных антигенов Treponema pallidum и их применение в иммуноферментной диагностике сифилиса.

Антитела к TmpA детектируются на всех стадиях сифилиса, однако образование антител к нему заканчивается на поздних стадиях заболевания. Между титром антител к TmpA и эффективностью лечения наблюдается существенная корреляция.

Задачей настоящего изобретения является получение гемагглютинационного теста на основе рекомбинантного белка – аналога полноразмерного TmpA антигена Т. pallidum, с помощью которого достигается повышение чувствительности РПГА при первичном сифилисе при одновременном сохранении высокой чувствительности и специфичности для всех стадий заболевания.

Лизаты бледных трепонем содержат широкий спектр антигенов, причем низкомолекулярные белки, включая TmpA, представлены в них в минимальных количествах. Известно, что на ранних стадиях сифилиса в организме больного образуются антитела в основном к низкомолекулярным антигенам. Поэтому гемагглютинационные тесты, построенные на лизатах культуральных и патогенных тренонем, не могут дать высокой чувствительности при первичном сифилисе. Именно использование рекомбинантного TmpA антигена в РПГА тест-системе позволило значительно поднять чувствительность диагностикума при тестировании образцов сывороток крови от больных ранними стадиями сифилиса.

Сущность предлагаемого технического решения состоит в том, что выявление специфических антител к Т. pallidum проводят реакцией пассивной гемагглютинации с помощью тест-системы, включающей в себя куриные эритроциты, сенсибилизированные рекомбинантным TmpA антигеном и окрашенный бромфеноловым синим буферный раствор для разведения сывороток и ликвора, содержащий 0,85-0,9% раствор натрия хлорида.

Технический результат, достигаемый настоящим изобретением, заключается в высокой чувствительности гемагглютинационного теста для всех стадий сифилиса, облегчении визуальной оценки внесения растворов и образцов сывороток крови, в оценке динамики инфекционного процесса и эффективности противосифилитического лечения по изменению титров специфических антител, в простоте выполнения теста и соответственно сокращении времени проведения анализа.

Данное техническое решение отличается от известных следующим.

1. Использованием единственного рекомбинантного белка – аналога TmpA липопротеина T. pallidum в качестве антигена, сорбированного на куриные эритроциты.

2. Введением в раствор для разведения сывороток красителя-индикатора – бромфенолового синего.

При создании нового гемагглютинационного теста был использован известный рекомбинантный аналог полноразмерного TmpA антигена Т. pallidum. Данный аналог TmpA антигена широко используется в ИФА. Особенности сенсибилизации рекомбинантных белков на разные твердые носители в ИФА и РПГА являются причиной разницы в детекции антител к одним и тем же антигенам двумя методами серодиагностики. Если в ИФА белки адсорбируются на поверхности полистиролового планшета за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также за счет образования водородных связей, то при сенсибилизации рекомбинантных антигенов на эритроциты основную роль играет ковалентное связывание. В зависимости от связи белка с носителем развиваются конформационные изменения, сопровождающиеся появлением новых, экранировкой имеющихся детерминант или, напротив, усилением их реакционной способности. Различия в ионной силе и рН реакционной смеси, в которой производится сенсибилизация антигенов, разница в температуре проводимого процесса также влияют на конформацию белков. Неизбежность сшивки молекул белка между собой, а не только с поверхностью эритроцита или иммунологического планшета, приводит к тому, что не все связанные молекулы белкового сенситина доступны для взаимодействия с соответствующими антителами. Известно, что антитела, вырабатываемые организмом против антигенных детерминант, представляют неоднородную популяцию, т.е. один и тот же антиген могут узнавать антитела, имеющие комплементарные ему структуры, но несколько отличающиеся по составу аминокислотных остатков в антигенсвязывающем центре. Отсюда ясно, что в зависимости от конформации белка с ним будут связываться разные антитела. Поэтому один и тот же рекомбинантный аналог TmpA антигена Т. pallidum в формате двух методов ИФА и РПГА по-разному будет проявлять свои антигенные свойства.

Из красителей был выбран бромфеноловый синий, как наиболее чувствительный в данной тест-системе.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Сенсибилизация куриных эритроцитов рекомбинантным белком TmpA

Сенсибилизацию куриных эритроцитов рекомбинантным антигеном TmpA проводили в присутствии хлористого хрома на водяной бане при 42°С в течение 60 минут (соотношения реагентов: 1 объем бидистиллированной воды, 0,1 объем 50% суспензии формализованных куриных эритроцитов, 0,1 объем раствора рекомбинантного антигена TmpA в концентрации 0,25 мг/мл, 0,1 объем 0,33% раствора хлористого хрома). Аналогично получали контрольные эритроциты – без добавления рекомбинантного антигена. Затем сенсибилизированные эритроциты (СЭ) и контрольные эритроциты (КЭ) трижды отмывали 0,85% раствором хлорида натрия. Осадок ресуспендировали в защитной среде в объеме, равном объему исходно взятой бидистиллированной воды, и в 4 объемах 0,85% раствора хлорида натрия с добавлением консерванта 10% раствора азида натрия (разведение 1:100). Состав защитной среды: 15% сахарозы, 0,5% буры, 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1, 25% борной кислоты. Диагностикум выдерживали для стабилизации 1-2 дня при 4°С и использовали в реакции.

Пример 2. Приготовление буферного солевого раствора (СР) – раствора для разведения сывороток и ликвора

СР получают смешиванием 100 объемов 0,85% раствора хлорида натрия и 0,04 объема 5% раствора бромфенолового синего. СР имеет фиолетовый цвет, который меняется при добавлении сыворотки крови на голубой.

Пример 3.Постановка РПГА и учет результатов

Качественный анализ

Тестирование образцов сывороток

1. Перед постановкой РПГА необходимо развести исследуемые образцы сывороток крови в 40 раз. Для этого в лунки круглодонного иммунологического планшета с помощью микропипетки внести СР по следующей схеме: 1 ряд – 190 мкл; 2 ряд – 25 мкл; 3 ряд – 25 мкл.

В лунки первого ряда добавить по 10 мкл исследуемых сывороток крови (разведение сывороток 1:20). При этом в лунках планшета цвет раствора с фиолетового меняется на голубой. Содержимое лунок тщательно перемешать пипетированием и перенести по 25 мкл образца в лунки второго ряда (разведение сывороток 1:40). Содержимое лунок тщательно перемешать и отбросить 25 мкл в емкость для сбора инфицированного материала. Чистыми наконечниками вновь отобрать из лунок первого ряда 25 мкл образца и перенести их в лунки 3 ряда (разведение сывороток 1:40). Содержимое лунок тщательно перемешать и отбросить 25 мкл в емкость для сбора инфицированного материала.

2. Для постановки положительного (К+) и отрицательного (К-) контролей в четыре лунки иммунологического планшета внести по 25 мкл СР. В 2 лунки добавить по 25 мкл К+, в другие 2 лунки по 25 мкл К-. Содержимое лунок тщательно перемешать и отбросить 25 мкл в емкость для сбора инфицированного материала. Поскольку положительный (К+) и отрицательный (К-) контроли уже разведены 1:20, предварительные разведения делать не нужно.

3. Каждая тестируемая сыворотка (в разведении 1:40), К+ и К- внесены в лунки планшета в двух повторах, к одной лунке добавить микропипеткой 25 мкл СЭ, ко второй 25 мкл КЭ. СЭ и КЭ вносить как можно быстрее и друг за другом. Содержимое лунок тщательно перемешать осторожным постукиванием по краю планшета 1-2 минуты. Планшет закрыть крышкой и оставить при комнатной температуре (20-24°С) на 30-40 минут.

Тестирование образцов ликвора

Перед постановкой РПГА необходимо развести исследуемые образцы ликвора в 20 раз. Для этого в лунки иммунологического планшета с помощью микропипетки внести СР по следующей схеме: 1 ряд – 90 мкл; 2 ряд – 25 мкл; 3 ряд – 25 мкл.

В лунки первого ряда добавить по 10 мкл исследуемых образцов ликвора (разведение 1:10). При этом цвет раствора в лунках планшета остается фиолетовым.

Далее аналогично тестированию образцов сывороток

Учет результатов

Учет результатов следует проводить визуально в условиях интенсивного освещения.

«+» – положительная реакция (полная агглютинация) – равномерно распределенный по дну и стенкам лунки слой эритроцитов в виде «зонтика» с ровными краями.

«+/-» – слабоположительная реакция (частичная агглютинация) – эритроциты образуют осадок в виде небольшого кольца с точечным просветом в центре.

«-» – отрицательная реакция (отсутствие агглютинации) – на дне лунки образуется компактный осадок эритроцитов в виде точки.

В контрольных лунках (К- + СЭ) агглютинация должна отсутствовать, в лунках (К+ + СЭ) должна наблюдаться полная агглютинация.

В лунках с КЭ агглютинация должна отсутствовать, ее наличие свидетельствует о содержании в образце антиэритроцитарных антител. В этом случае

– 1 вариант: тест должен быть повторен после абсорбции исследуемой сыворотки, т.е. необходимо развести сыворотку контрольными эритроцитами КЭ в соотношении 1:4 и оставить на 1 ч при температуре 20-24°С, затем отцентрифугировать в течение 3-5 мин при 1 тыс. об/мин. Отобрать 25 мкл супернатанта и развести в 4 раза СР (разведение сыворотки 1:20). Затем развести сыворотку еще в 2 раза и провести повторное тестирование с СЭ и КЭ (смотри «Качественный анализ»).

– 2 вариант: проводится последовательное двукратное титрование образца сыворотки по двум вертикальным рядам планшета (смотри «Количественный анализ»). К первому ряду добавить СЭ, ко второму ряду добавить КЭ. Если титр сыворотки с СЭ больше титра сыворотки с КЭ, то сыворотку считать положительной. Если титр сыворотки с КЭ больше титра сыворотки с СЭ или они равны, то сыворотку считать отрицательной.

Количественный анализ

Положительные в РПГА сыворотки могут быть использованы для количественного анализа – определения титра, т.е. наибольшего разведения образца, в котором наблюдается гемагглютинация, для этого необходимо следующее.

1) Внести микропипеткой по 25 мкл СР в лунки вертикальных рядов. Количество вертикальных рядов должно соответствовать числу тестируемых сывороток плюс 1 ряд для раститровки К+.

2) В лунку А1 внести 25 мкл образца из соответствующей лунки с разведением сыворотки 1:20, которая была использована для качественного метода. Содержимое лунки тщательно перемешать осторожным пипетированием и перенести 25 мкл в лунку В1, после чего содержимое лунки тщательно перемешать и перенести 25 мкл в лунку С1 и так повторять до конца вертикального ряда, включая лунку H1. После перемешивания 25 мкл содержимого лунки H1 отобрать и сбросить в емкость для инфицированного материала. Таким образом, в вертикальном ряду получают разведения сыворотки от 1:40 до 1:5120. Образцы следующих положительных сывороток раститровать аналогично. Одновременно с титрованием исследуемых образцов произвести титрование К+. Поскольку положительный контроль (К+) уже разведен 1:20, его следует использовать, не делая предварительных разведений.

3) В каждую лунку внести по 25 мкл СЭ (конечные разведения тестируемой сыворотки от 1:80 до 1:10240). Перемешать содержимое лунок, осторожно постукивая по краям планшета 1-2 минуты. Планшет закрывается крышкой и оставить на 30-40 мин при 20-24°С. Учет результатов реакции проводится также, как в качественном анализе.

Пример 4. Изучение диагностической эффективности разработанного гемагглютинационного теста проводилось с использованием образцов сывороток крови 396 больных сифилисом, 94 человек, получивших лечение по поводу сифилиса, 760 здоровых доноров и 1102 сыворотки крови больных с различными инфекциями, не связанными с сифилисом.

Данные по оценке чувствительности данной тест-системы для разных стадий сифилиса представлены в таблице 1.

Данные по числу ложноположительных результатов в тест-системе для разных групп больных, не имеющих отношение к сифилису, представлены в таблице 2.

Специфичность разработанной тест-системы, оцененная на 760 здоровых донорах составила 98,95%.

Пример 5. Сравнение диагностической эффективности, разработанной тест-системы с известными тест-системами «Люис РПГА тест» (Ниармедик плюс, Россия), «Сифилис РПГА-тест» (ЭКОлаб, Россия) и «ИФА-анти-Люис» (НПО «Диагностические системы», Россия). Представленные в таблицах 3, 4 и 5 данные указывают на высокую чувствительность предлагаемой тест-системы для всех стадий сифилиса.

ПРЕИМУЩЕСТВА ТЕСТА

– Предложенная тест-система позволяет выявлять специфические противотрепонемные антитела с более высокой чувствительностью, чем гемагглютинационные тесты на основе лизатов Т. pallidum.

– Визуальная оценка внесения всех компонентов и образцов.

Предложенный диагностический набор позволяет использовать известную реакцию РПГА только с одним антигеном – TmpA антигеном Т. pallidum для оптимального выявления специфических антител в образцах сывороток больных всеми стадиями сифилитической инфекции.

Формула изобретения

Тест-система для выявления специфических противотрепонемных антител для диагностики сифилиса реакцией пассивной гемагглютинации, отличающаяся тем, что она включает в себя формализованные куриные эритроциты, сенсибилизированные рекомбинантным антигеном – аналогом TmpA антигена Т. pallidum, и буферный раствор для разведения сывороток и ликвора, содержащий 0,85-0,9% раствор натрия хлорида, окрашенный красителем-индикатором, представляющим собой 5% раствор бромфенолового синего.