Патент на изобретение №2305832

(54) СПОСОБ РАЗДЕЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИПТОФАНА И ТИРОЗИНА В ВОДНОМ РАСТВОРЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к аналитической химии органических соединений и может быть использовано при разработке процессов непрерывной ферментации белков в серийных анализах производства фармацевтических препаратов. В способе раздельного определения триптофана и тирозина в водном растворе предварительно готовят водный раствор триптофана и тирозина с исходными концентрациями 0,01 и 0,1 мг/мл соответственно, затем в него добавляют высаливатель – кристаллический сульфат лития в количестве 20-25 мас.% по отношению к количеству водного раствора аминокислот, перемешивают до полного растворения соли, к приготовленному водно-солевому раствору триптофана и тирозина добавляют экстрагент – предварительно подготовленную бинарную смесь гидрофильных растворителей в объемном соотношении водно-солевого раствора и смеси экстрагентов 10:1, причем смесь гидрофильных растворителей готовят из 60 мас.% бутилового спирта и 40 мас.% ацетона, затем экстрагируют на вибросмесителе в течение 5 мин, выдерживают 1-2 мин, экстракт отделяют, определяют в экстракте содержание триптофана и тирозина методом потенциометрического титрования. Для этого строят дифференциальный график зависимости изменения ЭДС раствора от объема добавляемого титранта. На дифференциальном графике зависимости изменения ЭДС от объема титранта имеются два максимума. Первый максимум соответствует объему титранта, пошедшему на титрование тирозина, второй – суммарному содержанию аминокислот в растворе. Степень извлечения (R, %) триптофана и тирозина рассчитывают по формуле: R=D·100/D+r, где D – коэффициент распределения триптофана и тирозина между бинарной смесью гидрофильных растворителей и водно-солевым раствором, r – соотношение равновесных объемов водной и органической фаз. Технический результат заключается в разработке способа раздельного определения триптофана и тирозина в водном растворе с применением экстракции бинарной смесью гидрофильных растворителей, позволяющей определять до 97-98% триптофана и 98-99% тирозина. 1 табл.

Изобретение относится к аналитической химии органических соединений и может быть использовано при разработке процессов непрерывной ферментации белков в серийных анализах производства фармацевтических препаратов.

Известно раздельное определение триптофана и тирозина в жидких средах по степени интенсивности флуоресценции или с помощью фотометрирования (SU 122339 A1, 17.02.1959; SU 1528394 A1, 15.12.1989).

Технической задачей изобретения является раздельное определение аминокислот – триптофана и тирозина в водном растворе с применением экстракции бинарной смесью гидрофильных растворителей.

Техническая задача достигается тем, что в способе раздельного определения триптофана и тирозина в водном растворе предварительно готовят водный раствор триптофана и тирозина с исходными концентрациями 0,01 и 0,1 мг/мл соответственно, затем в него добавляют высаливатель – кристаллический сульфат лития в количестве 20-25 мас.% по отношению к количеству водного раствора аминокислот, перемешивают до полного растворения соли, к приготовленному водно-солевому раствору триптофана и тирозина добавляют экстрагент – предварительно подготовленную бинарную смесь гидрофильных растворителей в объемном соотношении водно-солевого раствора и смеси экстрагентов 10:1, причем смесь гидрофильных растворителей готовят из 60 мас.% бутилового спирта и 40 мас.% ацетона, затем экстрагируют на вибросмесителе в течение 5 мин, выдерживают 1-2 мин, экстракт отделяют, определяют в экстракте содержание триптофана и тирозина методом потенциометрического титрования. Для этого строят дифференциальный график зависимости изменения ЭДС раствора от объема добавляемого титранта. На дифференциальном графике зависимости изменения ЭДС от объема титранта имеются два максимума. Первый максимум соответствует объему титранта, пошедшему на титрование тирозина, второй – суммарному содержанию аминокислот в растворе. Степень извлечения (R, %) триптофана и тирозина рассчитывают по формуле:

R=D·100/D+r,

где D – коэффициент распределения триптофана и тирозина между бинарной смесью гидрофильных растворителей и водно-солевым раствором, r – соотношение равновесных объемов водной и органической фаз.

Технический результат заключается в разработке способа раздельного определения триптофана и тирозина в водном растворе с применением экстракции бинарной смесью гидрофильных растворителей, позволяющей определять до 97-98% триптофана и 98-99% тирозина.

Предлагаемый способ раздельного определения триптофана и тирозина в водном растворе осуществляют по следующей методике.

К 30 мл водного раствора триптофана и тирозина с исходными концентрациями 0,01 мг/мл и 0,1 мг/мл соответственно добавляют 20-25 мас.% высаливателя сульфата лития, раствор перемешивают до полного растворения соли. Затем к водно-солевому раствору триптофана и тирозина добавляют 3 мл бинарной смеси гидрофильных растворителей (соотношение водно-солевого раствора аминокислот и экстрагента составляет 10:1), которую готовят из 60 мас.% бутилового спирта и 40 мас.% ацетона. Далее экстрагируют на вибросмесителе 5 мин, выдерживают 1-2 мин для расслаивания равновесных фаз, экстракт отделяют, количественно переносят в ячейку для потенциометрического титрования и титруют 0,01 моль/л раствором КОН в безводном этиловом спирте. Индикаторным электродом служит стеклянный электрод, электродом сравнения – хлоридсеребряный электрод, заполненный насыщенным раствором KCl в этиловом спирте. Электродвижущую силу раствора триптофана и тирозина измеряют на высокоомном потенциометре.

На дифференциальном графике зависимости изменения ЭДС от объема титранта имеются два максимума. Первый максимум соответствует объему титранта, пошедшему на титрование тирозина, второй – суммарному содержанию аминокислот в растворе. Органическая фаза содержит 97 – 98% триптофана и 98-99% тирозина по отношению к исходному содержанию в анализируемом растворе.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1

Готовят 30 мл раствора триптофана и тирозина с концентрациями 0,01 и 0,1 мг/мл соответственно, добавляют высаливатель – кристаллический сульфат лития в количестве 20 мас.%. Раствор перемешивают до полного растворения соли, добавляют 3 мл бинарной смеси гидрофильных растворителей, содержащей 60 мас.% бутилового спирта и 40 мас.% ацетона, соотношение водно-солевого раствора и экстрагента 10:1. Экстрагируют на вибросмесителе 5 мин, выдерживают 1 минуту, экстракт отделяют, не захватывая водного слоя, количественно переносят в ячейку для потенциометрического титрования и титруют 0,01 моль/л раствором КОН в безводном этиловом спирте. Индикаторный электрод – стеклянный электрод, электрод сравнения – хлоридсеребряный. Потенциал раствора измеряют на высокоомном потенциометре и строят дифференциальный график зависимости изменения ЭДС от объема титранта.

На графике имеются два максимума. Первый соответствует объему титранта, пошедшему на титрование тирозина, второй – суммарному содержанию аминокислот в растворе. Органическая фаза содержит 97,6% триптофана и 98,5% тирозина по отношению к исходному содержанию аминокислот в анализируемом растворе. Данные анализа представлены в таблице.

Достигается практически полное (97-98 мас.%-ное) извлечение триптофана и 98-99 мас.%-ное извлечение тирозина, способ выполним.

Пример 2.

Анализ выполняют аналогично примеру 1, но к водному раствору триптофана и тирозина добавляют кристаллический сульфат лития в количестве 25 мас.%. В органическую фазу переходит 97,1% триптофана и 98,7% тирозина от содержания в исходном растворе. Достигается практически полное (97-98 мас.%-ное) извлечение триптофана и тирозина, способ выполним. Данные анализа представлены в таблице.

В ходе эксперимента было установлено, что экстракция в отсутствии высаливателя не приводит к образованию органической фазы, способ невыполним. При содержании компонентов в бинарной смеси экстрагентов, отличном от заявляемого, не достигается практически полное (97-98 мас.%-ное) извлечение триптофана и тирозина.

Положительный эффект по предлагаемому способу достигается при содержании высаливателя 20-25 мас.%, применении бинарной смеси гидрофильных растворителей, состоящей из 60 мас.% бутилового спирта и 40 мас.% ацетона, при объемном соотношении смеси растворителей и водно-солевого раствора 1:10.

Формула изобретения

Способ раздельного определения триптофана и тирозина в водном растворе, характеризующийся тем, что в способе раздельного определения триптофана и тирозина в водном растворе предварительно готовят водный раствор триптофана и тирозина с исходными концентрациями 0,01 и 0,1 мг/мл соответственно, затем в него добавляют высаливатель – кристаллический сульфат лития в количестве 20-25 мас.% по отношению к количеству водного раствора аминокислот, перемешивают до полного растворения соли, к приготовленному водно-солевому раствору триптофана и тирозина добавляют экстрагент – предварительно подготовленную бинарную смесь гидрофильных растворителей в объемном соотношении водно-солевого раствора и экстрагента 10:1, причем смесь гидрофильных растворителей готовят из 60 мас.% бутилового спирта и 40 мас.% ацетона, затем экстрагируют на вибросмесителе в течение 5 мин, выдерживают 1-2 мин, экстракт отделяют, определяют в экстракте содержание триптофана и тирозина методом потенциометрического титрования, для чего строят дифференциальный график зависимости изменения ЭДС раствора от объема добавляемого титранта, на дифференциальном графике зависимости изменения ЭДС от объема титранта имеются два максимума, первый максимум соответствует объему титранта, пошедшему на титрование тирозина, второй – суммарному содержанию аминокислот в растворе, степень извлечения (R, %) триптофана и тирозина рассчитывают по формуле

R=D·100/D+r,

где D – коэффициент распределения триптофана и тирозина между смесью растворителей и водно-солевым раствором, r – соотношение равновесных объемов водной и органической фаз.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 23.02.2008

Извещение опубликовано: 20.11.2009 БИ: 32/2009