Патент на изобретение №2304775
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, в частности к молекулярно-генетическим исследованиям, например к области диагностики сердечно-сосудистых заболеваний. В основу изобретения положена задача создания диагностического набора (ДН) для проведения медико-генетического анализа предрасположенности к мультифакториальным, в том числе сердечно-сосудистым заболеваниям, универсального вследствие смешивания компонент и добавления в набор широкой группы олигопраймеров, и разработка способа диагностики, который вследствие оптимизации условий полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) характеризуется: простотой и удобством в применении; высокой скоростью анализа: 2-3 дня (за счет стандартизации протокола анализа); снижением затрат на диагностические операции. Данное решение позволяет в короткие сроки проводить диагностику многофакторных заболеваний в короткие сроки, а также возможность применения диагностического набора как в специализированных клиниках, так и в лабораториях широкого спектра. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.
(56) (продолжение): CLASS=”b560m”240(1), pp.75-88. MUSTAFINA O.E. et al. Endothelial nitric Oxide synthase gene minisatellite polymorphism: Study in populations in Volga-Ural region and analysis of associations with myocardial infarct and essential hypertension. Genetica, 2001, May, 37(5), p.668-674.
Изобретение относится к медицине, в частности к молекулярно-генетическим исследованиям, например к области диагностики сердечно-сосудистых заболеваний. Одним из наиболее перспективных и успешно развивающихся направлений мировой и отечественной науки являются молекулярно-биологические технологии – основа для проведения медико-генетического анализа. Эти технологии представляют собой обширную и очень разнообразную группу методов, предназначенных для исследования и анализа генома организмов (от бактерии до человека), выявления и идентификации вариаций в структуре исследуемого участка нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) вплоть до расшифровки и установления первичной последовательности его оснований. Основой молекулярно-биологических методов диагностики являются различной степени сложности технологические манипуляции с нуклеиновыми кислотами, предварительно экстрагированными из клеток и тканей организма. Большое значение в современной медицине имеет персонализированный подход к человеку. Он заключается, прежде всего, в выборе вполне определенных диагностических маркеров, необходимых для анализа конкретной патологии. Кроме того, не меньшее значение имеет совершенствование и упрощение методов анализа биологического материала, что выражается в создании целого ряда диагностических наборов, основанных на современных технологиях и направленных на упрощение работы по диагностике заболеваний без потери качества и точности полученного результата. Известен способ исследования генетических маркеров, включающий выделение ДНК, постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР), проведение энзиматической рестрикции и электрофореза в полиакриламидном геле (И.Е.Зазерская и др. Анализ ассоциации генов VDR3 и COLIA1 с постменуальным остеопорозом, Остеопороз и остеопатии, 2002, №2, с.3). Недостатком этого способа является то, что анализ в этом случае осуществляется в несколько этапов, что усложняет и удорожает диагностику. Известен способ диагностики мультифакториальных заболеваний, включающий выделение ДНК, проведение ПЦР для определения мутаций и/или полиморфизма гена, состоящей из первичной денатурации, цикла из денатурации, отжига и синтеза, заключительного синтеза, а также соответствующий диагностический набор, включающий 67 мМ трис-HCl, рН 8.8 при 25°С; 16.6 мМ (NH4)2SO4; 6.7 мМ MgCl2; 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 0,2 ед/мкл (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, с.5.3-5.31, с.6.36-6.45, 9.14-9.23, 14.14-14.19). Недостатком этого способа и набора является то, что с их помощью невозможно осуществить мультиплексный анализ сразу нескольких генов, что приводит к замедлению процесса анализа, увеличению трудозатрат при проведении анализа, усложнению протокола диагностики заболеваний. В основу изобретения положена задача создания диагностического набора (ДН) для проведения медико-генетического анализа предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям, универсального вследствие смешивания компонент и добавления в набор широкой группы олигопраймеров; разработка способа диагностики, который вследствие оптимизации условий полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) характеризуется простотой и удобством в применении, высокой скоростью анализа: 2-3 дня (за счет стандартизации протокола анализа), снижением затрат на диагностические операции, в результате чего создается методика проведения анализа, позволяющая использовать вышеуказанный диагностический набор как в специализированных клиниках, так и в лабораториях широкого спектра. Достижение вышеупомянутой технической задачи обеспечивается тем, что в диагностическом наборе для определения предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, включающем компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции и компоненты для проведения энзиматической рестрикции, компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (67 мМ трис-HCl, рН 8.8 при 25°С; 16.6 мМ (NH4)2SO4; 6.7 мМ MgCl2; 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильная ДНК-полимераза 0,2 ед/мкл) смешаны в одном объеме, а компоненты для проведения энзиматической рестрикции (эндонуклеазы Msp I и Hinf I) смешаны в другом объеме, а в набор дополнительно включены крезол, набор из ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции и энзиматической рестрикции, вода ампулированная и олигопраймеры 5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′ 5′-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3′ 5′-AGGCCCTATGGTAGTGCCTT-3′ 5′-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3′ 5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′ 5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′ 5′-AGGAGGTAGAGAGTCGCCAT-3′ 5′-AAAGAGTCCCAGCCCTACCT-3′. В способе диагностики предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, включающем выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции для определения мутаций и/или полиморфизма гена, состоящей из первичной денатурации, цикла из денатурации, отжига и синтеза, и заключительного синтеза, проведение гидролиза продуктов полимеразной цепной реакции эндонуклеазами рестрикции Msp I и Hinf I, и электрофорез в полиакриламидном геле, проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию с использованием n пар праймеров, где n Наличие смеси компонент, дополнительное введение крезола, набора из ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции и энзиматической рестрикции, воды ампулированной и олигопраймеров в диагностический набор позволяет значительно ускорить процесс анализа, удешевить процедуру диагностики, сделать ее более доступной независимо от условий проведения. Предложенные условия проведения анализа позволяют с помощью диагностического набора быстро, дешево и точно осуществить диагностику предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям. Состав набора можно представить в виде следующей схемы, которая показана на чертеже. В набор входят следующие компоненты: 1 – упаковочная коробка для набора, 2 – комплект №1 для проведения ПЦР (смесь для мультиплексной ПЦР с крезолом – 100 шт.(РС))- состав и количество веществ в одном комплекте смеси: 67 мМ трис-HCl, рН 8.8 при 25°С; 16.6 мМ (NH4)2SO4; 6.7 мМ MgCl2; 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и олигопраймеры 0.001 оптической единицы каждого TaqAHK полимераза -концентрация 0,2 ед/мкл (П)), объем смеси для одной реакции – от 10 до 25 мкл, 3 – комплект №2 для проведения энзиматической рестрикции (буфер для эндонуклеазы рестрикции (БР) – это смесь 1:1 однократных буферов О и G (фирмы производителя эндонуклеаз – «Сибэнзим»), смесь(и) эндонуклеаз рестрикции (Р)) – это смесь эндонуклеаз рестрикции Hinf l и Msp l в конечных концентрациях 0,5 ед/мкл, объем смеси для одной реакции – 5 мкл, 4 – положительный контроль для ПЦР и энзиматической рестрикции (К) – это образец(ы) ДНК с известными генотипами, например тетрагетерозигота По гену АСЕ – I/D По гену NOS3 – 4/5 По гену MTHFR – С/T Погену Gpllla – А1/А2 5 – вода ампулированная (В). В заявляемом изобретении предлагается новый модифицированный вариант идентификации аллелей генов путем использования набора олигопраймеров и, что особенно важно, температурного режима, позволяющих проводить мультиплексную полимеразную цепную реакцию. Характеристика изученных полиморфных вариантов генов и последовательности олигопраймеров приведены в таблице 1.
Способ состоит их VI этапов и осуществляется следующим образом. Объясним это на примере осуществления способа с использованием заявляемого диагностического набора для четырех пар праймеров. 1) На первом этапе выделяют ДНК пациента по стандартному протоколу (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, с.9.14-9.23). 2) Далее проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию с использованием n пар праймеров, где n
3) После окончания ПЦР специфичность амплификации и количество амплификата (анализируемого образца и положительного контроля) проверяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по стандартному протоколу (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, с.6.36-6.45). 4) Далее осуществляли гидролиз амплифицированных фрагментов ДНК (анализируемого образца и положительного контроля) эндонуклеазами рестрикции Msp I и Hinf I по стандартному протоколу (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, с.5.28-5.32), используя комплект №2 и ампулированную воду. 5) Продукты гидролиза (анализируемого образца и положительного контроля) разделяли в 7,5% неденатурирующем полиакриламидном геле, приготовленном на трис-боратном буфере (ТБЕ) в аппарате для вертикального электрофореза с длиной стекла 20 см. Для получения 30% раствора акриламида смешивали 29 г акриламида с 1 г N,N-метилен-бис-акриламида и растворяли смесь в 100 мл дистиллированной воды. 10-кратный раствор ТБЕ готовили, растворяя 54 г триса, 27,5 г борной кислоты и 20 мл 0,5М ЭДТА рН 8,0 в 0,5 л дистиллированной воды. Для приготовления 20 мл 7,5% полиакриламидного геля смешивали 5 мл 30% акриламида, 2 мл 10-кратного ТБЕ, 13 мл дистиллированной воды, 200 мкл 10% раствора персульфата аммония и 25 мкл тетраметилэтилендиамина. Перед заливкой раствор тщательно перемешивали. Пробы (образцы) наносили в гель в объеме 5 мкл каждого продукта гидролиза в свою лунку. Электрофорез проводили в 1-кратном ТБЕ при напряжении электрического поля 120 В, пока образцы не входили в гель и не проходили около 1 см от лунок. После этого напряжение увеличивали до 180-200 В. Останавливали электрофоретическое разделение, когда до выхода крезола из геля оставалось 3-7 см. 6) Гель с продуктами гидролиза (анализируемого образца и положительного контроля) окрашивали водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл), просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе и фотографировали на системе видео-гель-документации. Сравнивали наличие «полос» анализируемого образца с таковыми у положительного контроля. Определяли генотип пациента. Выдавали заключение по результатам анализа. Например, нами с помощью диагностического набора получены следующие результаты: По гену АСЕ – D/D По гену NOS3 – 4/4 По гену MTHFR – С/С По гену Gpllla – А1/А1 На основании теста у пациента выявлен риск группы с-с заболеваний, связанных с регуляцией давления – ИБС, инфаркт миокарда, эссенциальная гипертензия (гипертоническая болезнь), атеросклероз.
Формула изобретения
1. Диагностический набор для определения предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, включающий компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции и компоненты для проведения энзиматической рестрикции, отличающийся тем, что компоненты для проведения полимеразной цепной реакции: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25°С; 16.6 мМ (NH4)2SO4, 6.7 мМ MgCl2, 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильная ДНК-полимераза в концентрации 0,2 ед/мкл смешаны в одном объеме, а компоненты для проведения энзиматической рестрикции – эндонуклеазы Msp I и Hinf I смешаны в другом объеме, а набор дополнительно включает крезол, набор из ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции и энзиматической рестрикции, вода ампулированная и олигопраймеры 5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′ 5′-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3′ 5′-AGGCCCTATGGTAGTGCCTT-3′ 5′-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3′ 5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′ 5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′ 5′-AGGAGGTAGAGAGTCGCCAT-3′ 5′-AAAGAGTCCCAGCCCTACCT-3′. 2. Способ определения предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, включающий выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции для определения мутаций и/или полиморфизма генов, состоящей из первичной денатурации, цикла из денатурации, отжига и синтеза и заключительного синтеза, проведение гидролиза продуктов полимеразной цепной реакции эндонуклеазами рестрикции Msp I и Hinf I, и электрофорез в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что проводят полимеразную цепную реакцию с использованием диагностического набора по п.1, при этом первичную денатурацию проводят в течение 7 мин при температуре 94°С, далее проводят цикл от 28 до 32 раз, включающий денатурацию при 94-96°С в течение от 1 мин до 1 мин 10 с, отжиг при температуре от 58 до 60°С в течение от 1 мин до 1 мин 10 с, синтез при температуре 72°С в течение от 1 мин до 1 мин 20 с, заключительный синтез в течение 5 мин при температуре 72°С, гидролиз продуктов полимеразной цепной реакции проводят смесью эндонуклеаз рестрикции, а электрофорез продуктов гидролиза проводят в 7,5% полиакриламидном геле до выхода маркера из геля, а затем определяют полиморфизм генов АСЕ, eNOS, MTHFR, GPIIIa. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве маркера используют крезол, и электрофорез проводят до выхода маркера из лунок геля на расстояние 3-7 см.
РИСУНКИ
QB4A – Регистрация лицензионного договора на использование изобретения
Лицензиар(ы): Глотов Олег Сергеевич, Демин Григорий Сергеевич
Вид лицензии*: НИЛ
Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью “ПреМед”
Договор № РД0047128 зарегистрирован 19.02.2009
Извещение опубликовано: 27.03.2009 БИ: 09/2009
* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4, и диагностического набора по п.1, при этом первичную денатурацию проводят в течение 7 минут при температуре 94°С, далее проводят цикл от 28 до 32 раз, включающий денатурацию при 94-96°С в течение от 1 минуты до 1 минуты 10 секунд, отжиг при температуре от 58 до 60°С в течение от 1 минуты до 1 минуты 10 секунд, синтез при температуре 72°С в течение от 1 минуты до 1 минуты 20 секунд, заключительный синтез в течение 5 минут при температуре 72°С, гидролиз продуктов полимеразной цепной реакции проводят смесью эндонуклеаз рестрикции, а электрофорез продуктов гидролиза проводят в 7,5% полиакриламидном геле до выхода маркера из геля, а затем определяют полиморфизм генов АСЕ, eNOS, MTHFR, GPIIIa. В качестве маркера используют крезол, а электрофорез проводят до выхода маркера из лунок геля на расстояние 3-7 см.