Патент на изобретение №2303461

(21), (22) Заявка: 2004137274/15, 05.08.2003

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

05.08.2003

(30) Конвенционный приоритет:

06.08.2002 GB 0218230.1
06.08.2002 GB 0218232.7
06.08.2002 GB 0218234.3
06.08.2002 GB 0218229.3

(43) Дата публикации заявки: 20.01.2006

(46) Опубликовано: 27.07.2007

(15) Информация о коррекции:

Версия коррекции № 1 (RI и белком комплемента C1q (Duncan, A. R. and Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A. R., Woolf, J. M., Partridge, L. J., Burton, D. R. and Winter, G. Localisation of the binding site for human FcRt on IgG. Nature 332, 563-564, 1988). Такие мутации, возможно, осуществляют для того, чтобы настроить свойства измененного антитела на достижение конкретного терапевтического эффекта – например связывания с антигеном и блокирования его функции без активации литических эффекторных механизмов.

На Фиг.2 (Seq ID No. 28) представлена аминокислотная последовательность легкой цепи химерного иммуноглобулина, в которой вариабельная область мышиной анти-MAG легкой цепи ассоциирована с функциональной сигнальной последовательностью секреции иммуноглобулина и с человеческой константной областью каппа.

Аналогично, анти-MAG вариабельные области могут быть ассоциированы с константными областями иммуноглобулина, которые лишены мутаций, блокирующих эффекторные функции. На Фиг.3 (Seq ID No. 29) представлена аминокислотная последовательность тяжелой цепи химерного иммуноглобулина, где вариабельная область тяжелой цепи мышиного анти-MAG антитела ассоциирована с функциональной сигнальной последовательностью секреции иммуноглобулина и с формой дикого типа константной области человеческого IgG1.

Согласно информации, представленной на Фиг.1-3, вставки кДНК, кодирующие эти химерные цепи, могут быть получены стандартными методами молекулярной биологии, хорошо известными специалистам в данной области техники. В кратком изложении, генетический код используется для идентификации нуклеотидных кодонов, кодирующих желательные аминокислоты, создавая виртуальную последовательность кДНК, кодирующую химерный белок. Если желательно, чтобы кДНК вставка экспрессировалась в конкретном организме, то могут быть выбраны имеющие особенные преимущества кодоны в соответствии с известными мнениями по использованию кодонов. Затем синтезируют желательную нуклеотидную последовательность посредством РСР (полимеразная цепная реакция) амплификации матрицы, содержащей перекрывающиеся синтетические олигонуклеотиды, которые при сближении представляют собой желательную последовательность. Полученный в результате продукт также может быть модифицирован посредством PCR или мутагенеза с присоединением сайтов рестрикции для облегчения клонирования в подходящую плазмиду для экспрессии или дополнительных манипуляций.

Пример 3 – Химерное антитело связывается с крысиным MAG в ELISA

Химерное анти-MAG антитело, содержащее CDR легкой и тяжелой цепей по данному изобретению, получали путем временной трансфекции СНО клеток. Для этого использовали реактив для трансфекции Transfast (Promega; E2431), и трансфекции осуществляли в соответствии с инструкциями производителей. В кратком изложении, приблизительно 10⁶ СНО клеток вносили в каждую лунку 6-луночных культуральных планшетов. На следующие сутки ДНК вектора экспрессии млекопитающего, кодирующую соответствующую тяжелую или легкую цепь, смешивали в отношении 1:1 (5 мкг ДНК всего) в среде (Optimeml с Glutamax; Gibco #51985-026). Добавляли реактив для трансфекции Transfast и раствор переносили в лунки с конфлюэнтными слоями клеток. Через 1 ч при 37°C в инкубаторе для клеток смесь ДНК/Transfast покрывали 2 мл среды Optimam и оставляли в инкубаторе на 48-72 ч. Супернатанты собирали, очищали центрифугированием и пропускали через фильтры 0,2 мкм. Концентрацию антител в супернатанте СНО клеточной культуры определяли посредством ELISA и оцениваемая концентрация составляла 0,5 мкг/мл. Для связывания MAG использовали имеющиеся в продаже крысиный MAG-Fc. Благодаря слиянию с человеческим Fc, химерные антитела нельзя обнаружить, используя вторичные антитела против человеческого IgG. Вместо этого использовали специфичное антитело против человеческой легкой цепи каппа. На Фиг.4 показано, что это химерное антитело связывается с MAG даже в разведении 1/64. Неродственное гуманизированное антитело и культуральный супернатант ложно-трансфецированных клеток не порождали какого-либо сигнала в этом анализе.

Методика:

Микротитрационные планшеты ELISA (Nunc Maxisorp) покрывали 1 мкг/мл слитым белком – крысиный MAG-Fc (R & D systems; 538-MG) в PBS (фосфатном буферном растворе) при 4°C в течение ночи. Планшеты дважды промывали PBS и затем блокировали смесью PBS/BSA (бычий сывороточный альбумин) (1 мас.%) в течение 1 ч при комнатной температуре (RT). Культуральные супернатанты временно трансфецированных СНО клеток пропускали через фильтры 0,2 мкм и последовательно разводили в смеси PBS/BSA, начиная с неразбавленного супернатанта до разведения 1/64. Разведенные образцы оставляли при комнатной температуре на 1 ч. Планшеты затем трижды промывали смесью PBS/Tween 20 (0,1 об.%). Обнаруживающее антитело представляло собой конъюгат – козье антитело специфичное против легкой цепи каппа человека с пероксидазой (Sigma A-7164), разбавленный 1/2000 в смеси PBS/BSA. Обнаруживающее антитело инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и планшеты промывали, как описано выше. Раствор субстрата добавляли (Sigma Fast OPD Р-9187) и инкубировали до момента обнаружения подходящего развития окраски и затем останавливали, используя 3 М H₂SO₄. Развитие окраски считывали при 490 нм.

Пример 4 – Гуманизированные антитела

Измененные антитела включают гуманизированные антитела, которые содержат гуманизированные вариабельные области, связанные с человеческими константными областями. Примеры цепей гуманизированных анти-MAG иммуноглобулиновых цепей по данному изобретению представлены на Фиг.5. Могут быть получены гуманизированные антитела с использованием константных областей человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD.

На Фиг.5 (Seq ID No. 30) представлен пример аминокислотной последовательности тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина, в которой вариабельная область гуманизированной анти-MAG тяжелой цепи ассоциирована с функциональной сигнальной последовательностью для секреции иммуноглобулина, и с измененной формой константной области человеческого IgG1, где Kabat остатки 248 и 250 изменены на аланин для того, чтобы блокировать эффекторные функции связывания с FcRI и белком комплемента C1q (Duncan, A. R. and Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A. R., Woolf, J. М., Partridge, L. J., Burton, D. R. and Winter, G. Localisation of the binding site for human FcRt on IgG. Nature 332, 563-564, 1988). Такие мутации возможно получают для того, чтобы настроить свойства измененного антитела на достижение конкретного терапевтического эффекта – например связывания с антигеном и блокирования его функции без активации литических эффекторных механизмов.

На Фиг.5 (Seq ID No. 31) также представлен пример аминокислотной последовательности легкой цепи гуманизированного иммуноглобулина, где вариабельная область гуманизированной анти-MAG легкой цепи ассоциирована с функциональной сигнальной последовательностью секреции иммуноглобулина и с человеческой константной областью каппа.

Аналогично анти-MAG вариабельные области могут быть ассоциированы с константными областями иммуноглобулина, которые лишены мутаций, блокирующих эффекторные функции. На Фиг.5 (Seq ID No. 32) представлена аминокислотная последовательность тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина, где вариабельная область анти-MAG тяжелой цепи ассоциирована с функциональной сигнальной последовательностью секреции иммуноглобулина и с константной областью формы дикого типа человеческого IgG1.

Согласно информации, представленной на Фиг.5, вставки кДНК, кодирующие эти гуманизированные цепи, могут быть получены стандартными методами молекулярной биологии, хорошо известными специалистам в данной области техники. В кратком изложении, генетический код используется для идентификации нуклеотидных кодонов, кодирующих желательные аминокислоты, создавая виртуальную последовательность кДНК, кодирующую белок. Если желательно, чтобы вставка кДНК экспрессировалась в конкретном организме, то могут быть выбраны кодоны, имеющие особенные преимущества, в соответствии с известными мнениями по использованию кодонов. Затем синтезируют желательную нуклеотидную последовательность посредством PCR амплификации матрицы, содержащей перекрывающиеся синтетические олигонуклеотиды, которые при сближении представляют собой желательную последовательность. Полученный в результате продукт также можно модифицировать посредством PCR или мутагенеза для присоединения сайтов рестрикции, чтобы облегчить клонирование в подходящую плазмиду для экспрессии или дополнительных манипуляций.

Пример 5 – Гуманизированные анти-MAG антитела связываются с крысиным и человеческим MAG в ELISA

1) Прямое связывание ELISA с крысиным MAG-Fc слитым белком нормализованных количеств культуральных супернатантов 9-ти гуманизированных комбинаций тяжелых и легких цепей

Гуманизированные анти-MAG антитела, содержащие CDR легких и тяжелых цепей по изобретению, получали посредством временной трансфекции СНО клеток. Для этого использовали реактив для трансфекции Transfast (Promega; E2431), и трансфекции осуществляли в соответствии с инструкциями производителей. В кратком изложении приблизительно 10⁶ СНО клеток вносили в каждую лунку 6-луночных культуральных планшетов. На следующие сутки ДНК вектора экспрессии млекопитающего, кодирующую подходящую тяжелую или легкую цепь, смешивали в соотношении 1:1 (5 мкг ДНК всего) в среде (Optimeml с Glutamax; Gibco #51985-026). Добавляли реактив для трансфекции Transfast и раствор переносили в лунки с конфлюэнтными слоями клеток. Через 1 ч при 37°С в инкубаторе для клеток смесь ДНК/Т ransfast покрывали 2 мл среды Optimam и оставляли в икубаторе на 48-72 ч. Супернатанты собирали, очищали центрифугированием и пропускали через фильтры 0,2 мкм. 9 комбинаций тяжелых и легких вариабельных цепей получали из последовательностей, представленных в приведенной ниже таблице, и константные области тяжелой цепи IgG1 были функциональны по отношению к Sed ID.

Концентрацию антител определяли посредством ELISA, и количества супернатантов, используемых в анализе, нормализовали к исходной концентрации 250 или 500 нг/мл (в зависимости от концентрации культурального супернатанта). В качестве антигена использовали имеющийся в продаже крысиный MAG-Fc (R&D Systems; 538-MG). Благодаря слиянию этого антигена с человеческим Fc связанные химерные антитела нельзя было обнаружить, используя обычные вторичные антитела против человеческого IgG. Вместо этого использовали специфичное антитело против человеческой легкой цепи каппа. На Фиг.6 показано, что все 9 гуманизированные антитела, испытанные здесь, связывались с крысиным MAG с очень похожими кривыми связывания до приблизительно 4 нг/мл. Используемое для сравнения химерное антитело демонстрировало характеристики связывания, которые попадали в группу испытанных здесь гуманизированных антител. Хотя и небезусловно, это может свидетельствовать о том, что аффинности испытанных здесь гуманизированных антител оказывались очень близко к диапазону аффинности используемого здесь для сравнения негуманизированного химерного антитела.

Методика:

96-луночные планшеты Nunc Maxisorp покрывали на ночь при 4°С слитым белком – крысиный MAG-Fc (1 мкг/мл; R & D systems; 538-MG) в PBS. Планшеты дважды промывали PBS, содержащим Tween 20 (0,1 об.%; PBST), и блокировали PBS, содержащим BSA (1 мас./об.%) в течение 1 ч при комнатной температуре (RT). Различные количества культуральных супернатантов последовательно разводили в блокирующем буфере и добавляли к блокированным лункам, начиная с приблизительно 500 или 250 нг/мл. Концентрации антител в супернатантах были основаны на независимых анализах, оценивающих количество гуманизированного антитела, присутствующего в каждом культуральном супернатанте. Для сравнения также было включено химерное мышино-человеческое (негуманизированное) антитело. Образцы антител инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и затем планшеты 3 раза промывали PBST. Добавляли вторичное антитело (конъюгат специфичного козьего антитела против человеческой легкой цепи с пероксидазой; Sigma A-7164), разбавленное 1/5000 в блокирующем буфере, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки промывали три раза, как описано выше, и связывание обнаруживали посредством добавления субстрата (таблетки OPD (орто-фенилендиамина дигидрохлорида), растворенные в соответствии с указаниями; Sigma P-9187). Следили за развитием окраски и реакцию останавливали, используя 3М H₂SO₄. Развитие окраски считывали при длине волны 490 нм.

2) Прямое связывание ELISA с крысиным MAG-Fc слитым белком двух очищенных комбинаций тяжелой-легкой цепей гуманизированного анти-MAG антитела

Два гуманизированных антитела, состоящих из комбинаций вариабельных областей тяжелых и легких цепей BVh1/CVI1 и BVh3/CVI3 (Таблица, Фиг.5) и мутантной константной области IgG1, пример которых представлен в виде SEQ ID No: 30 (представляет собой BVh1/CVI1 мутантный IgG1, специалист в данной области техники может легко получить последовательность для BVh3/CVI3 эквивалента), получали посредством увеличенной в масштабе версии временной трансфекции, описанной в Примере 3, и очищали, используя аффинную хроматографию с белком А. Вещество очищенных антител диализовали против PBS и концентрацию определяли путем считывания OD280 (оптической плотности при длине волны 280 нм). Концентрации антител доводили до 5000 нг/мл и использовали в качестве последовательных разведении в ELISA связывании крысиного MMAG-Fc. На Фиг.7 показано, что очищенное вещество антител связывается с крысиным MAG-Fc и что обе комбинации вариабельных областей тяжелых и легких цепей были, испытанные здесь, очень похожи.

Способ:

96-луночные Nunc Maxisorp планшеты покрывали на ночь при 4°C слитым белком – крысиный MAG-Fc (2,5 мкг/мл; R & D systems; номер по каталогу 538-MG) в PBS. Планшеты дважды промывали PBS, содержащим Tween 20 (0,1% об.; PBST), и блокировали PBS, содержащим BSA (1 мас./об.%), в течение 1 ч при комнатной температуре (RT). Очищенное гуманизированное антитело доводили до исходной концентрации 5 мкг/мл в блокирующем буфере и затем последовательно разводили. Образцы антител инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, и затем планшеты три раза промывали PBST. Добавляли вторичное антитело (конъюгат специфичного козьего антитела против человеческой легкой цепи и пероксидазы; Sigma A-7164), разбавленное 1/5000 в блокирующем буфере, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки трижды промывали, как описано выше, и связывание обнаруживали добавлением субстрата (таблетки OPD, растворенные в соответствии с инструкциями; Sigma P-9187). Следили за развитием окраски, и реакцию останавливали, используя 3М H₂SO₄. Развитие окраски считывали при 490 нм.

Результаты:

Очищенные гуманизированные антитела, как не несущие, так и несущие мутации в каркасе, демонстрировали очень похожее связывание с крысиным MAG. Результаты представлены на Фиг.7.

3) Связывание с человеческим MAG, экспрессируемым на ОНО клетках, нормализованных количеств культурального супернатанта для двух гуманизированных комбинаций тяжелых и легких цепей

Гуманизированные вариабельные комбинации тяжелой и легкой цепей, аналогичные описанным в Примере 5.2, тестировали в виде очищенных супернатантов против человеческого MAG, экспрессируемого на поверхности СНО клеток. Количество культурального супернатанта, используемого для каждого антитела, нормализовали на основании на концентраций антител, определенных ELISA. Для этого 96-луночные планшеты (Nunc Maxisorp) покрывали на ночь при 4°С козьими антителами против человеческой IgG (гамма) цепи (Sigma I-3382; в бикарбонатном буфере рН 9,6; 2 мкг/мл). На следующие сутки планшеты дважды промывали промывочным буфером (PBST) и блокировали добавлением по меньшей мере 75 мкл блокирующего буфера (PBS, содержащего 1 мас./об.% BSA) в течение 1 ч при комнатной температуре. Раствор с образцами антител последовательно разводили в блокирующем буфере (первое разведение – неразведен или разведен вдвое) в двух парралелях. Стандарт Ab представлял собой очищенное гуманизированное IgG1 антитело, имеющее неродственную специфичность и известную концентрацию. Стандартный раствор также последовательно разводили на планшете, начиная с 500 нг/мл. Растворы антител инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза, как описано выше, и затем инкубировали с конъюгатом специфичного (свободного и связанного) козьего антитела против человеческой легкой (каппа) цепи и пероксидазы; Sigma А-7164), разбавленным 1/5000 в блокирующем буфере, в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты снова промывали три раза, как описано выше, и инкубировали с раствором субстрата (таблетки OPD; Sigma P-9187) до развития сильной окраски. Развитие окраски останавливали добавлением 25 мкл 3 М H₂SO₄, и планшеты считывали при 490 нм.

На Фиг.8 показано, что оба испытанные здесь антитела распознают человеческий MAG и очень близки по своим связывающим характеристикам. СНО/- представляет собой отрицательный контроль СНО клеток, у которых не экспрессируется MAG.

Способ Eu-ELISA на основе клеток

96-луночные планшеты (Costar 3595) заполняли 100 мкл клеточной суспензии/лунку (смотри в приведенной ниже таблице рекомендуемое количество клеток для проведения анализа на 1, 2, 3 или 4 сутки).

Культуральную среду удаляли и планшеты блокировали DMEM (среда Игла в модификации Дулбекко) / F12 (Sigma D6421), содержащей FCS (фетальную телячью сыворотку) (10%), BSA (1%), NaN₃ (1%, блокирующий буфер) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем блокирующий раствор удаляли, и добавляли образец (в блокирующем буфере 50 мкл/лунку). Образцы инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Планшеты затем промывали три раза PBS, используя аппарат для промывки планшетов Skatron. После промывания клетки фиксировали 0,5%-ным параформальдегидом (разбавленным в PBS) в течение 20 минут при 4°С и снова промывали, как описано выше. Добавляли 50 мкл/лунку вторичного антитела, конъюгированного с европием, разбавленного в европиевом буфере (50 мМ Tris-основания, 150 мМ NaCl, 0,5% BSA, 0,1 г/л Tween 20, 7,86 мг/л DTPA (диэтилентриаминпентауксусной кислоты) при рН 7,3) и инкубировали в течение 1 ч при 4°С.

Планшеты промывали, как описано выше, и добавляли 200 мкл усиливающего раствора Delphia/лунку. Раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 5-10 минут. Лунки считывали в течение 24 часов на аппарате Victor.

4) Конкурентный ELISA для связывания с крысиным MAG-Fc слитым белком двух очищенных гуманизированных антител и негуманизированного мышиного моноклонального антитела

96-луночные планшеты Nunc Maxisorp покрывали на ночь при 4°С крысиным MAG-Fc слитым белком (2,5 мкг/мл; R&D systems; 538-MG) в PBS. Планшеты дважды промывали PBS, содержащим Tween 20 (0,1 об.%; PBST), и блокировали PBS, содержащим BSA (1 мас./об.%), в течение 1 ч при комнатной температуре (RT). Очищенное гуманизированное антитело доводили до исходной концентрации 200 нг/мл и смешивали в равном объеме с конкурентными молекулами, приготовленными в блокирующем буфере, в интервале от 6000 до 0 нг/мл. Конкуренты представляли собой или парентеральное мышиное моноклональное антитело (анти-MAG) или неродственное мышиное моноклональное антитело (INN1) в тех же концентрациях (только BVh1/CVI1). Растворы антитело/конкурент инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и затем планшеты промывали три раза PBST. Добавляли вторичное антитело (конъюгат специфичного козьего антитела против человеческой легкой цепи и пероксидазы; Sigma A-7164), разбавленное 1/5000 в блокирующем буфере, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки трижды промывали, как описано выше, и связывание обнаруживали добавлением субстрата (таблетки OPD, растворенные в соответствии с инструкциями; Sigma P-9187). Развитие окраски измеряли при 490 нм.

Результаты:

С обоими препаратами очищенного антитела в равной степени конкурировало исходное мышиное моноклональное антитело, но не мышиное моноклональное антитело, которое обладало неродственной специфичностью – смотри Фиг.9. Это указывает на то, что исходное мышиное моноклональное антитело и гуманизированные антитела, испытываемые здесь, возможно, распознают один и тот же эпитоп и, возможно, обладают очень близкими аффинностями к крысиному MAG.

Формула изобретения

1. Гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент, которые связываются с MAG (миелин-ассоциированным гликопротеином) и нейтрализуют его и которые содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 13 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 16.

2. Антитело по п.1 для лечения неврологического заболевания/расстройства, выбранного из группы, состоящей из травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга и периферической невропатии.

3. Фармацевтическая композиция, нейтрализующая MAG, содержащая антитело по п.1 вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

4. Композиция по п.3 для лечения или профилактики инсульта.

5. Композиция по п.4 в форме, подходящей для внутривенного введения.

6. Композиция по п.3 для лечения другого неврологического заболевания/расстройства, выбранного из группы, состоящей из травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга и периферической невропатии.

РИСУНКИ

TH4A – Переиздание описания изобретения к патенту Российской Федерации

Причина переиздания: Коррекция библиографических данных

Извещение опубликовано: 27.12.2007 БИ: 36/2007