Патент на изобретение №2303067

(54) СПОСОБ ГЕНОДИАГНОСТИКИ УСТОЙЧИВОСТИ ОВЕЦ К СКРЕПИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ предусматривает проведение амплификации (ПЦР-анализа) фрагмента гена прионового протеина овец, включающего 3 основных информативных кодона – 136, 154, 171. После проведения ПЦР-анализа подготовленные ампликоны гибридизируют с секвенирующими праймерами и диагностируют нуклеотидную последовательность гена в трех наиболее информативных кодонах (136, 154 и 171) в режиме реального времени с одновременным определением 7 аминокислот (A, R, Q, Н, V, Т и К) с применением технологии пиросеквенирования. Устанавливают генотип, тип которого позволяет сделать заключение об устойчивости овец к скрепи на основании предварительно установленных классов генетической устойчивости G1-G5. Способ позволяет провести прижизненную диагностику резистентности овец к патогенному приону на уровне генотипа, обладает высокой точностью и невысокой трудоемкостью. 2 ил., 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной генетики, в частности к способам генодиагностики устойчивости овец к скрепи.

Известен способ диагностики скрепи, основанный на гистологическом исследовании головного мозга животных, имевших при жизни симптомы поражения центральной нервной системы и убитых в терминальной стадии болезни (Методические указания по патогистологической диагностике прионных инфекций животных, – Минсельхозпрод России, Деп. Ветеринарии. – 06.05.1997. – N. 13-17-2/939). Недостатком данного способа диагностики является патогистологический характер исследований, основанный на несовместимой с жизнью диагностике прионной инфекции.

^ARR/ARR

Известен способ генодиагностики полиморфизма гена прионового протеина с использованием метода дот блот гибридизации с ³²

При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа генодиагностики устойчивости овец к скрепи, обеспечивающего прижизненную диагностику резистентности овец к патогенному приону на уровне генотипа и повышающего ее точность при сокращении затрат на выполнение анализа.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ генодиагностики устойчивости овец к скрепи, предусматривающий проведение амплификации (ПНР-анализа) фрагмента гена прионового протеина овец, включающего 3 основных информативных кодона – 136, 154, 171, и отличающийся тем, что после проведения ПЦР-анализа подготовленные ампликоны гибридизируют с секвенирующими праймерами и диагностируют нуклеотидную последовательность гена в трех наиболее информативных кодонах (136, 154 и 171) в режиме реального времени с одновременным определением 7 аминокислот (A, R, Q, Н, V, Т и К) с применением технологии пиросеквенирования и выявлением генотипов, отнесенных к 5-ти классам генетической устойчивости овец к скрепи (G1-G5).

Генодиагностику устойчивости овец к скрепи выполняли следующим образом:

1) исходя из последовательности гена прионового протеина овец, соответствующему аллелю “дикого типа” были подобраны олигонуклеотидные праймеры, 5′-конец одного из которых мечен биотином, амплифицирущие участок гена PrP овец длиной 262 пар оснований (п.о.) (генный банк AY326330) (фиг.1):

262Sc for (позиции 372-389) – 5′-AGCCCAGTAAGCCAAAAACC-3′

262Sс rev bio (позиции 622-641) – 5′-BIO-GTGTGTTGCTTGACTGTGATGT-3′;

2) выполняли 44 цикла ПНР в 50 мкл реакционной смеси следующего состава: 1xПЦР буфер (16.6 мМ (NH₄)₂SO₄, 67.7 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl₂), 200 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: 1 цикл – 96°С 10 мин, 44 цикла последовательно – 96°С – 0,5 мин, 58°С – 0,5 мин, 72°С – 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С – 7 мин;

3) проверку результативности прохождения ПЦР диагностировали методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 1,5% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1xТАЕ буфере 20 мин при 120 V и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ);

4) оставшиеся 45 мкл амплификатов делили на 2 аликвоты по 20 мкл и смешивали в круглодонных пластиковых 96-луночных плашках с 3 мкл сефарозы (Streptavidin Sepharose, 17-5113-03) и 57 мкл связывающего буфера (Binding Buffer, 40-0033), инкубировали при комнатной температуре 10 мин, интенсивно перемешивая на шейкере при 1400 rpm/мин;

5) с использованием вакуумной рабочей станции (Vacuum Prep Workstation (220-240 V), 60-0207) связанные с сефарозной матрицей ПЦР-продукты переносили на препарационные фильтры и последовательно промывали по 10 сек в 70% этиловом спирте, 0,2 М NaOH (для денатурации ДНК), 1х промывочном буфере (Wasching Buffer, 40-0035). После отключения вакуума пробы 5-10 сек элюировали в подготовленные тонкостенные пластиковые 96 луночные плашки (PSQ 96 Plate Low, 40-0010), содержащие в каждой лунке 45 мкл Annealing Buffer (40-0036) в смеси с 15 пикомолями секвенирующих праймеров, подобранных к местам мутаций в аминокислотах 136, 154 и 171 гена прионового белка овец. Нами были выбраны три секвенирующих праймера: Sc seq136 5′-GCTACAGTCGTGGAAG-3′ и Sc seq154 5′-CTATGAGGACCGTTACTAT-3′(дуплекс); и Sc seq171 5′-TGTACTACAGACCAGTGGAT-3′ (мультиплекс), и разработана схема анализа, позволяющая одновременно определять полиморфизм амплифицированного участка гена PrP овец в позициях 2 кодонов 136 и 154 (дуплекс), а также в позициях 1, 2 и 3 кодона 171 (мультиплекс) (фиг.2). Для диагностики в 136 кодоне треонина (Т), образующегося при замене первого нуклеотида триплета GCCACC, мы предложили использование одного секвенирующего праймера Sc seq136 5′-GCTACAGTCGTGGAAG-3′;

6) подготовленные таким образом пробы помещали в термостат, инкубировали 2 мин при 90°С для гибридизации секвенирующих праймеров с одноцепочечной ДНК-матрицей, по окончании охлаждали при комнатной температуре в течение 10 мин;

7) генодиагностику проводили на автоматическом пиросеквенаторе PSQ 96MA SYSTEM (Pyrosequencing AB) с использованием реагентов из набора PSQ 96 SNP Reagent Kit 5х96 (40-0023) в режиме реального времени. Для идентификации нуклеотидной последовательности ДНК каждого конкретного индивидуума в позициях 2 аминокислот 136/154 (дуплекс) разработали следующую схему раскапывания азотистых оснований и считывания результатов – CGAGTGTCGATGCAT; для кодона 171 с идентификацией каждого из трех нуклеотидов триплета – TCAGTGATAG, для диагностики треонина в кодоне 136 – CTGAGTCGATG;

8) обработку «сырых» данных пиросеквенирования изучаемых SNP проводили с использованием программного обеспечения PSQ96MA SNP software v.2.0. Определенные таким образом для каждого животного аллели суммировали в электронной таблице Microsoft Excel. Полученная матрица генотипов служила основой для статистической обработки результатов.

Пример. Контрольное использование предложенного способа для генодиагностики разводимых пород овец России на устойчивость к скрепи было апробировано на 875 животных 19 популяций 13 пород (табл.1).

Были диагностированы как наиболее часто встречающиеся аллели ARR, ARQ, AHQ, ARH, VRQ, так и выявлены 2 редко встречающихся аллеля гена прионового белка овец TRQ и ARK. Во всех исследованных породах был выявлен наиболее предпочтительный аллель ARR, ответственный за резистентность к скрепи. Частота встречаемости аллеля ARR варьировала от 61,67% в асканийской до 28,23% в грозненской породах. Грубошерстные породы овец, кроме каракульской, отличались низкой частотой встречаемости аллеля ARR. Наименьшая частота встречаемости данного аллеля была отмечена у овец романовской породы – 2,17%. В 8-ми из 13-ти породах овец был диагностирован скрепи-чувствительный аллель VRQ с частотой встречаемости в интервале 1,58%-10,77% у овец пород ромни-марш и цигайская соответственно. Аллель ARK определен у 2 животных ставропольской и 3 каракульской пород. Каракульская порода уникальна еще и тем, что только в ней нет животных с нежелательным аллелем VRQ, и, напротив, выявлены 7 животных с редчайшим аллелем TRQ.

В зависимости от диагностированных аминокислот в позициях 136/154/171 животные были ранжированы на 5 классов генотипов устойчивости к скрепи (табл.2, 3).

В 10-ти из 13-ти исследованных породах выявлены животные со скрепи резистентным генотипом AR-R/ARR (G1), что является необходимым условием для проведения дальнейшей селекционной работы в рамках повышения естественной устойчивости овец к скрепи.

Максимальное процентное соотношение животных класса G1 было выявлено в 2-х породах – русской длинношерстной и асканийской, что составило соответственно 42,55 и 36,67%. В 4-х породах (советский меринос, грозненская, волгоградская, цигайская) число животных, относящихся к первому классу, находилось на уровне 10-18%. У овец ставропольской породы и ромни-марш данный показатель составил чуть больше 7%. Число животных с генотипом ARR/ARR в каракульской и эдильбаевской породах было минимальным (4,72 и 1,96% соответственно), а в таких породах, как калмыцкая, кучугуровская, романовская не было выявлено вовсе. В 5-ти породах – одной тонкорунной (асканийская) и четырех грубошерстных (каракульская, эдильбаевская, калмыцкая, кучугуровская) отсутствуют животные с нежелательными генотипами, которые относятся к классам G4 и G5. Число животных с редкими генотипами, устойчивость которых к скрепи неизвестна и которые вынесены нами в группу GX, составило 1,94% в ставропольской породе и 7,88% в каракульской.

Предложенный способ может быть использован в биотехнологии сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма гена PrP овец с целью последующего использования полученных результатов в популяционной генетике, разведении и селекции овец.

Формула изобретения

Способ генодиагностики устойчивости овец к скрепи, предусматривающий проведение амплификации (ПЦР-анализа) фрагмента гена прионового протеина овец, включающего три основных информативных кодона – 126, 154, 171, отличающийся тем, что после проведения ПЦР-анализа подготовленные ампликоны гибридизируют с секвенирующими праймерами и диагностируют нуклеотидную последовательность гена в трех наиболее информативных кодонах (136, 154 и 171) в режиме реального времени с одновременным определением семи аминокислот (A, R, Q, Y, V, Т и К) с применением технологии пиросеквенирования и установлением генотипа, тип которого позволяет сделать заключение об устойчивости овец к скрепи на основании предварительно установленных классов генетической устойчивости G1-G5.

РИСУНКИ