Патент на изобретение №2303059

Published by on




РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ



ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(19) RU (11) 2303059 (13) C1
(51) МПК

C12N1/20 (2006.01)
C12Q1/04 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Статус: по данным на 29.11.2010 – прекратил действие

(21), (22) Заявка: 2005131110/13, 10.10.2005

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

10.10.2005

(46) Опубликовано: 20.07.2007

(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске:
GB 1003977, 08.09.1965. SU 1692441 A1, 01.01.1962. BAKONYI Т., DERAKHSHIFAR I., GRABENSTEINER E. Development and evalution of CPR assays for the detection of Paenibacillus larvae in honey samples: compansion with isolation and biochemical characterization. Appl. Environ Microbiol., 2003. 69 (3), 1504.

Адрес для переписки:

109428, Москва, Рязанский пр-кт, 24, корп.1, ГНУ ВИЭВ

(72) Автор(ы):

Леонтьева Ирина Александровна (RU),
Гробов Олег Федорович (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Государственное научное учреждение (ГНУ) Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (RU)

(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И СОХРАНЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГНИЛЬЦОВЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПЧЕЛ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования и длительного сохранения в музейных условиях возбудителей гнильцовых болезней пчел. Питательная среда в 1 л гидролизата казеина с содержанием аминного азота 140-150 мг% содержит агар-агар или агар Дифко. Изобретение позволяет увеличить выход биомассы, повысить спорообразование питательной среды, способствует длительному сохранению возбудителей гнильцовых болезней пчел. 2 табл.

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и может быть применено в пчеловодстве для культивирования и длительного сохранения в музейных условиях возбудителей гнильцовых болезней пчел.

Европейский гнилец – болезнь открытого расплода. Возбудители: Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus (доброкачественный гнилец); Enterococcus faecalis (кислый гнилец) культивируются на мясопептонных средах (МПА, МПБ).

Парагнилец – инфекционное заболевание личинок позднего возраста и куколок. Возбудитель – Bacillus paraalvei, культивируется на мясопептонных средах (МПА, МПБ).

Американский гнилец (злокачественный гнилец) – инфекционное заболевание пчелиных семей, приводящее к ослаблению и гибели печатного расплода (взрослые личинки и предкуколки), вызываемое спорообразующим микроорганизмом Paenibacillus larvae subsp. larvae, для культивирования которого требуются специальные среды, т.к. для его роста и споруляции необходимы дополнительные питательные вещества. Переход вегетативных клеток в спорулирующие необходим для сохранения музейных культур возбудителя американского гнильца.

Для культивирования возбудителя американского гнильца в настоящее время применяют среды: Бейли, Томашеца, молочно-желточную среду Уиллиса-Гоббза.

СРЕДА БЕЙЛИ: имеет в составе: 10% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, 1% крахмала, 0,1360 г КН2PO4, 1% агар (рН 6,6) [1].

СРЕДА ТОМАШЕЦА: мясопептонная среда с добавлением 10% нормальной лошадиной сыворотки (рН 6,8-7,0) [2].

СРЕДА УИЛДИСА-ГОББЗА – молочно-желточная эмульсия, 2% мясопептонный агар (рН 7,0-7,2) [3].

Известна также среда, имеющая в составе: казеин 1-3,65%; кукурузный настой 1,0-5%; крахмал 0-9,2%; сахарозу 0,6-3,5%; неочищенную патоку 0-9,2%; дрожжи 0,5-0,8%; Na2PO4 0,42-0,60%; КН2PO4 0,17-0,24%. (рН 6,5-7,5). Ближайший аналог [4].

Недостаток среды – трудоемкий технологический процесс приготовления (рецептура состава: 8 компонентов). Среда не обеспечивает ранний рост, спорообразование и длительную сохранность возбудителя американского гнильца пчел.

В задачу исследований входило создание универсальной питательной среды, которая давала бы быстрый рост, максимальное накопление биомассы, раннее и интенсивное спорообразование, способствовала длительному сохранению возбудителей гнильцовых болезней пчел в музейных условиях, в частности для труднокультивируемого возбудителя американского гнильца.

Предложенная нами среда содержит гидролизат казеина, полученный путем разбавления дистиллированной водой до содержания аминного азота 140-150 мг%, кипячения при перемешивании 5 минут; добавления 5% NaOH и доведения рН 7,8-8,0; добавления агара “Дифко” – 15 г/л или агар-агара (одесского) – 20 г/л; смесь кипятят при перемешивании 5 минут; доводят рН 7,2-7,4 20% HCl; среду фильтруют и стерилизуют при 121°С 20 минут. После стерилизации рН 7,0-7,2. Среда применена для культивирования и сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел, преимущественно для трудно культивируемого возбудителя американского гнильца Paenibacillus larvae subsp. larvae, показав преимущественные результаты в сравнении с рекомендуемым средами: (Бейли, Томашеца, молочно-желточной средой Уиллиса-Гоббза).

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1
Сравнительная оценка биологических свойств возбудителя американского гнильца пчел Paenibacillus larvae subsp. larvae
№ п Показатели Среда Томашеца Среда Бейли Среда Уиллиса-Гоббза Предложенная среда
1 2. 3. 4 5 6
1 Первичный рост 72-96 ч 48-72 ч 48 ч 18-24 ч
2 Интенсивность роста ++ ++ +++ +++
3 Накопление биомассы (концентрация смыва) 500 млн/см3 500 млн/см3 1 млрд/см3 2 млрд/см3
4 Спорообразование отсутствует 96 ч. 200-300 спор/см3 72 ч. 500-550 спор/см3 72 ч. 800-1000 спор/см3
5 Биологические свойства (культурально-морфологические, гемолитические, биохимические). 10 пересевов Изменение биологических свойств Не изменялись Не изменялись Не изменялись
6 Цикл пересевов 2 недели 4 недели 1,5 мес. 3 мес.

Установлено, что предложенная среда в отличие от рекомендованных способствует раннему проявлению первичного роста (18-24 ч); максимальному накоплению биомассы (48 ч – 2 млрд/см3); быстрому спорообразованию (72 ч – 800-1000 спор/см3); многократные пересевы не изменяли биологических свойств возбудителя американского гнильца пчел, а жизнеспособность музейных культур увеличивалась до 3 месяцев.

Установлено, что возбудители европейского гнильца (Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterospores, Enterococcus faecalis) и парагнильца (Bacillus paraalvei) при культивировании на предложенной среде при многократных пересевах (10 пассажей) не изменяли биологических свойств, наблюдалось усиленное накопление биомассы (2-2,2 млрд/см3, быстрое спорообразование (48 ч – 800-1000 спор/см3), ранний первичный рост (18-24 ч), увеличивался цикл пересевов возбудителей (3 мес) при хранении в музейных условиях.

Результаты исследования приведены в таблице 2.

Таблица 2
Сравнительная оценка биологических свойств возбудителей европейского гнильца (Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus Enterococcus faecalis) и парагнильца (Bacillus paraalvei)
Показатели Мясопептонные среды: (мпа,мпб) Предложенная среда
1. 2. 3. 4.
1. Первичный рост 24 ч 18-24 ч
2. Интенсивность роста +++ +++
3. Накопление биомассы (концентрация смыва) 1-1,8 млрд/см3 2-2,2 млрд/ см3
4. Спорообразование 72 ч. 500-700 спор/см3 48 ч. 800-1000 спор/см3
5. Биологические свойства (культурально-морфологические, гемолитические, биохимические). 10 пересевов Не изменялись Не изменялись
6. Цикл пересевов 2 мес 3 мес

Апробация предложенной среды проведена на 100 музейных штаммах возбудителей гнильцовых болезней пчел с положительными результатами.

Преимущество среды – универсальность, упрощение и удешевление технологического процесса изготовления (рецептура содержит 2 компонента). Среда дает возможность длительного сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел в музейных условиях.

Предложенная среда найдет применение в бактериологических лабораториях, для культивирования и сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел, в диагностических исследованиях и в производстве биопрепаратов.

Источники информации

1. Книга: «Опасные болезни и вредители пчел.», под редакцией О.Ф.Гробова и других, М.: Нива России, с.5.

2, 3. Там же, с.6.

4. GB №1003977 от 08.09.1965 – ближайший аналог.

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования и сохранения возбудителя гнильцовой болезни пчел – американского гнильца – Paenibacillus larvae subsp. larvae, европейского гнильца Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus, Enterococcus faecalis, содержащая в 1 л гидролизата казеина с содержанием аминного азота 140-150 мг% 15-2,0 г агар-агара или агара Дифко, рН среды 7,2±0,2.


MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 11.10.2007

Извещение опубликовано: 27.06.2009 БИ: 18/2009


Categories: BD_2303000-2303999