Патент на изобретение №2303057

(54) ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА ASPERGILLUS ACULEATUS – ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО КСИЛАНАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ, ПЕКТИНАЗЫ И КСИЛОГЛЮКАНАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в различных отраслях спиртовой и пищевой промышленности, в кормопроизводстве, в сельском хозяйстве. Штамм Aspergillus aculeatus ВКМ F-3766D обладает способностью продуцировать комплекс карбогидраз, включающий целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, маннаназы и пектиназы, содержащий ферменты высокого уровня активности. Изобретение обеспечивает возможность получения полного комплекса ферментов для гидролиза полисахаридов растительного сырья, а также, при необходимости, отдельных индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса. Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, в целлюлозно-бумажной промышленности, в пищевой и спиртовой промышленности, в пивоварении, качестве кормовых добавок, для силосования кормов в сельском хозяйстве.

Наиболее близкими по технической сущности к предлагаемому изобретению являются штаммы гриба Aspergillus niger, при глубинном культивировании которых на средах с индукторами целлюлолитических ферментов получают комплекс ферментов, включающих целлюлазу, ксиланазу, бета-глюкозидазу, бета-ксилозидазу, бета-глюканазу и ламинариназу (Патент РФ № 2057179, кл. C12N9/42, 1996 г.). Активности ферментов в культуральной жидкости составляют, соответственно: целлюлаза – 5,0 Е/мл; ксиланаза – 125,0 Е/мл; -глюкозидаза – 20,0 Е/мл; -ксилозидаза – 36,0; -глюканаза – 0,95 Е/мл и ламинариназа – 1,25 Е/мл.

Однако, несмотря на то, что грибы рода Aspergillus образуют комплексы ферментов с широким спектром карбогидраз, активность большинства отдельных компонентов комплекса у штаммов Asp.niger, указанных в изобретении, недостаточно высокая, что делает нецелесообразным их практическое применение.

Техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в получении нового высокоактивного штамма мицелиальных грибов – продуцента мультиферментного комплекса, содержащего спектр карбогидраз, расщепляющих некрахамальные полисахариды, и свободного от целлюлаз или содержащего низкую целлюлазную активность.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в повышении скорости обработки целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих субстратов при использовании предлагаемого штамма.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать штамм мицелиального гриба Aspergillus aculeatus Iizuka Aj 79-178 – продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы.

Штамм гриба Asp.aculeatus Iizuka Aj 79-178 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ F-3766D.

Штамм получают с помощью многоступенчатого классического мутагенеза и селекции из исходной культуры Asp.aculeatus BKM F-3743D. Суспензию спор исходного штамма, полученную в дистиллированной воде с добавлением 0.1% Твина-80, облучают ультрафиолетом (облучение световым потоком мощностью 3 м Вт/см²) в течение 3-х мин. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), ксилана, пектина или ксилоглюкана, культивируют при 28°С в течение 2 суток и проводят окрашивание Конго Красным. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза целлюлаз, -глюканаз, ксиланаз, пектиназ и ксилоглюканаз при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах наиболее активные варианты по -глюканазной, ксиланазной, пектиназной и ксилоглюканазной аквтиностям и наименее активные по целлюлазной (КМЦ-азной) активности снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше.

Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4°С при обязательных пересевах не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.

Культурально-морфологические признаки штамма.

Колонии на Чапек-агаре с дрожжевым экстрактом (CYA) при температуре культивирования 25°С имеют диаметр 35-37 мм на 7 сутки; слабо радиально-бороздачатые, поверхность слабо бархатистая до кожистой, край неровный, окраска колоний белая, эксудат отсутствует, обратная сторона охряно-желтая, окраска в конидиальной области коричневая; текстура плотная, ровная, порошистая; разверз радиально-складчатый, тускло-желтоватый; воздушный мицелий плотный, белый.

Колонии на Чапек-агаре с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы (CY20S) при температуре культивирования 25°С имеют диаметр более 27-33 мм на 7 сутки роста; гладкие, край неровный до 5 мм, окраска светло-коричневая в конидиальной области; текстура плотная, ровная, шерстистая до порошистой в центре колоний; реверз ровный, палево-желтый; воздушный мицелий плотный, белый; экссудат отсутствует, обратная сторона неокрашенная.

Колонии на Мальц-экстракт-агаре (МЕА) при температуре культивирования 25°С имеют диаметр 42-45 мм на 7 сутки роста; слабо- радиально-бороздчатые, поверхность шерстистая, край неровный, окраска колонии – черно-коричневая; текстура плотная, ровная, порошистая; реверз слабо-радикально-складчатый, тускло-желтовато-коричневый; экссудат отсутствует, воздушный мицелий скудный, белый, обратная сторона неокрашенная.

Колонии на Чапек-агаре с дрожжевым экстрактом (CYA) при температуре культивирования 37°С имеют диаметр 60 мм на 7 сутки роста.

Микроскопические характеристики.

Редуцированные конидиальные головки колонковидные; образуются на средах CYA и МЕА, на среде CY20S спороношение отсутствует. Конидиеносцы слабо окрашены, в районе апикального расширения до коричневатых, гладкостенные 100-500 (2000)×6.0-12.0 мкм, апикальные расширения шаровидные, толстостенные ((28,8)-35-65 (97,2) (среднее значение 52.1) мкм в диаметре). Фалиды одноярусные 4.5-9.0×2.7-4.8 мкм, формируются по всей поверхности апикального расширения. На конидиеносцах формируются только шаровидные апикальные расширения 15-35 мкм в диаметре с зачатками стеригм менее 1 мкм, конидии отсутствуют.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,25 ч^-1, в конце культивирования 0,1-0,15 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма.

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения pH роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при pH 2,5, но при этом наблюдается очень слабое образование ферментов класса карбогидраз.

Резистентность к нистатину слабая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост полностью подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний сильно уменьшается.

Является прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннит, маннозу, трегалозу, L- и D-арабинозу, сорбозу, сорбит, рибозу.

Не ассимилирует: L-рамнозу, D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу, 5-тио-D-глюкозу.

Использует аммонийный и органический азот, хуже ассимилирует нитратную форму азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: крахмале, ксилане, ламинарине, бета-глюкане, лихенине, галактоманнане, пектине, ксилоглюкане.

Катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз значительно снижена. Проверка катаболитной репрессии биосинтеза карбогидраз заключается в следующем. Конидии пересевают в пробирки с минимальной средой, содержащей минеральные соли, следовое количество (0,5 г/л) дрожжевого экстракта, ксилан или пектин, а также исследуемый репрессор или антиметаболит (глюкоза, 2-дезокси-D-глюкоза, лактоза, глицерин и др.). Диаметр пробирки – 9 мм, высота столбика агара 50-60 мм. Пробирку инкубируют 4 суток при 30°С и затем 20 ч при 45°С. Об устойчивости биосинтеза карбогидраз к катаболитной репрессии судят по глубине зоны деструкции ксилана или пектина (по размеру зоны просветления столбика агара в пробирке) в присутствии репрессора или антиметаболита).

Полученный мутант Asp.aculeatus Aj 79-178 (F-3766D) по своим морфологическим признакам при росте на глюкозо-картофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма Asp.aculeatus F-3743D) сниженной интенсивностью спороношения, цветом пигмента спор и окраской колонии (белая вместо черно-коичневой) с обратной стороны при выращивании на агаризованных средах, более медленным ростом на твердых средах, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу различных карбогидраз – -глюканаз, ксиланаз, пектиназ и ксилоглюканаз, при этом совсем не образуя или образуя очень незначительное количество целлюлаз.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения».

Культивирование штамма Asp.aculeatus Aj 79-178 (F-3766D) проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии на питательной среде, содержащей один или несколько субстратов – источников углерода, являющихся индукторами биосинтеза ферментов. В качестве субстратов могут использоваться и субстраты, не являющиеся индукторами. Штамм способен в соответствующих условиях проведения процесса культивирования на основе использования растворимых субстратов, например глюкозы, и в присутствии источников индукторов (ксилозы, различные растительные отходы) секретировать в культуральную среду комплекс ферментов – карбогидраз (-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и ксилоглюканаз и др.). Глюкоза в среде культивирования может быть заменена более дешевым продуктом – гидролизатом крахмала.

Активность -глюканаз, ксиланаз, ксилоглюканаз, пектиназ и целлюлаз (КМЦ-азы) в культуральной жидкости определяют по способности расщеплять. -глюкан, ксилан, ксилоглюкан, полигалактуроновую кислоту и КМЦ соответственно. За единицу -глюканазной, ксиланазной, ксилоглюканазной, пектиназной и КМЦ-азной активностей принимают такое количество ферментов, которое в течение 1 мин при температуре 50°С и pH 5,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, В.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учебное пособие, М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов, получаемых высушиванием или гранулированием.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Ферментация в качалочных колбах. Для получения посевного материала (инокулята) культуру гриба Asp.aculeatus Aj 79-178 (F-3766D) выращивают на сусло- или глюкозо-картофельном агаре при 29°С в течение 4 суток и далее – при комнатной температуре на свету с течение 5 суток. Засев колб проводят 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1% твина-80. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл жидкой среды следующего состава, в г/л: свекловичный жом – 10,0; солодовые ростки – 30,0; (NH₄)₂SO₄ – 3,0; NaNO₃ – 3,0; КН₂РО₄ – 4,0; MgSO₄×7H₂O – 0,5; pH 4,5-5,0. Колбы инкубируют на качалке при 29°С и 200 об/мин в течение 132-144 ч.

Активности ксиланаз, пекгиназ, -глюканаз, ксилоглюканаз и целлюлаз составляют 450, 50, 150, 7 и 0,8 ед/мл соответственно, что не хуже исходного штамма по активности целлюлаз и выше на 200%, 350%, 150%, 200% и 150% по активности ксиланаз, пектиназ, -глюканаз и ксилоглюканаз.

Пример 2. Ферментация штамма Asp.aculeatus Aj 79-178 (F-3766D) в качалочных колбах. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера, как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: свекловичный жом – 10,0; солодовые ростки – 15,0; (NH₄)₂SO₄ – 3,0; NaNO₃ – 3,0; КН₂PO₄ – 4,0; MgSO₄×7H₂O – 0,5; pH 4,5-5,0. Колбы инкубируют на качалке при 29°С и 200 об/мин в течение 132-144 ч.

Активности ксиланаз, пектиназ, -глюканаз, ксилоглюканаз и целлюлаз составляют 270, 95, 150, 10 и 0,6 ед/мл соответственно, что не хуже исходного штамма по активности целлюлаз и выше на 150%, 300%, 130% и 250% по активности ксиланаз, пектиназ, -глюканаз, ксилоглюканаз.

Пример 3. Культивирование штамма Asp.aculeatus Aj 79-178 (F-3766D) осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера, как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: размолотый овес – 15; солодовые ростки – 15; (NH₄)₂SO₄ – 3,0; NaNO₃ – 3,0; КН₂РО₄ – 4,0; MgSO₄×7H₂O – 0,5; pH 4,5-5,0. Колбы инкубируют на качалке при 29°С и 200 об/мин в течение 144 ч.

Активности ксиланаз, пектиназ, -глюканаз, ксилоглюканаз и целлюлаз составляют 670, 24, 160, 15 и 0,3 ед/мл соответственно, что не хуже исходного штамма по активности целлюлаз и выше на 450%, 140%, 250% и 300% по активности ксиланаз, пектиназ, -глюканаз и ксилоглюканаз.

Пример 4. Ферментация штамма Asp.aculeatus Aj79-178 (F-3766D) в ферментере. Проводят процесс культивирования в ферментере типа АНКУМ 2М с общим объемом 10 л и рабочим объемом 6 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Ферментер инокулируют 500 мл вегетативного мицелия, полученного через 48 ч культивирования 30°С на качалочных колбах Эрленмейера, содержащих среду следующего состава, в г/л: глюкоза – 10,0; дрожжевой экстракт – 5,0; (NH₄)₂SO₄ – 3,0; NaNO₃ – 3,0; KH₂PO₄ – 4,0; MgSO₄×7Н₂O – 0,5; pH 4,5-5,0.

Первую фазу культивирования (на которой гриб главным образом растет и накапливает биомассу) осуществляют в течении 48 ч при 30°С и pH 4,0. Состав питательной среды: свекловичный жом – 10,0; солодовые ростки – 20,0; (NH₄)₂SO₄ – 3,0; NaNO₃ – 3,0; КН₂РО₄ – 4,0; MgSO₄×7H₂O – 0,5.

После потребления растворимых сахаров, которое наблюдают обычно через 48 ч и о котором судят по повышению значения pO₂, начинают вторую фазу культивирования (на протяжении которой происходит накопление ферментов в среде роста). На второй фазе ферментации (фаза биосинтеза внеклеточных ферментов) в ферментер непрерывно добавляют водный раствор углеводов общей концентрацией 50%, состоящий из смеси глюкоза:ксилоза (4:1) так, чтобы общая концентрация углеводов в питательной среде в ферментере не превышала уровня 1 г/л. Начальная скорость подачи смеси составляет 3 мл/л/ч.

Активности ксиланаз, пектиназ, -глюканаз, ксилоглюканаз и целлюлаз составляют на 144 ч культивирования 1700, 110, 250, 50 и 0,8 ед/мл соответственно, что не хуже исходного штамма по активности целлюлаз и выше на 750%, 450%, 350% и 500% по активности ксиланаз, пектиназ, -глюканаз и ксилоглюканаз.

Пример 5. Ферментация штамма Asp.aculeatus Aj 79-178 (F-3766D) в ферментере. Проводят процесс культивирования в ферментере типа АНКУМ 2М с общим объемом 10 л и рабочим объемом 6 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Инокулируют 500 мл вегетативного мицелия, полученного через 36 ч культивирования на качалочных колбах Эрленмейера (по примеру 4).

Используют питательную среду следующего состава, в г/л: размолотый овес – 20; солодовые ростки – 20; глюкоза – 16,0; ксилоза – 4,0; (NH₄)₂SO₄ – 3,0; NaNO₃ – 3,0; KH₂PO₄ – 4,0; MgSO₄×7H₂O – 0,5.

Первую фазу культивирования (на которой гриб главным образом растет и накапливает биомассу) осуществляют в течение 46 ч при 30°С и pH 4,0.

На второй фазе ферментации (фаза биосинтеза внеклеточных ферментов) в ферментер непрерывно добавляют водный раствор углеводов общей концентрацией 25%, состоящий из смеси глюкоза:ксилоза (10:1) так, чтобы общая концентрация углеводов в питательной среде в ферментере не превышала уровня 1 г/л. Начальная скорость подачи смеси составляет 3 мл/л/ч.

Активности ксиланаз, пектиназ, -глюканаз, ксилоглюканаз и целлюлаз составляют на 144 ч культивирования 1300, 25, 450, 45 и 0,5 ед/мл соответственно, что не хуже исходного штамма по активности целлюлаз и выше на 400%, 200%, 500% и 450% по активности ксиланаз, пектиназ, -глюканаз и ксилоглюканаз.

Таким образом, предлагаемый штамм Aspergillus aculeatus Aj 79-178 (F-3766D) обладает способностью продуцировать комплекс, содержащий ферменты высокого уровня активности и состоящий из карбогидраз-ксиланаз, пектиназ, -глюканаз и ксилоглюканаз и практически лишенный целлюлаз. Это создает возможность получения полного комплекса ферментов для гидролиза некрахмальных полисахаридов растительного сырья, а также, при необходимости, отдельных индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса.

Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.

Препараты, получаемые на основе предлагаемого штамма, позволяют существенно увеличить эффективность и расширить спектр использования ферментных препаратов в различных областях биотехнологии и, особенно, в качестве кормовых добавок.

Формула изобретения

Штамм мицелиального гриба Aspergillus aculeatus BKM F-3766D – продуцент комплекса карбогидраз, содержащего ксиланазы, пектиназы, ксилоглюканазы и -глюканазы и проявляющего низкую активность целлюлаз.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 15.11.2007

Извещение опубликовано: 20.07.2008 БИ: 20/2008

NF4A – Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 27.07.2008

Извещение опубликовано: 27.07.2008 БИ: 21/2008