Патент на изобретение №2302664

(54) СПОСОБ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ ЭРИТРОПОЭЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальному обоснованию терапии для коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при энцефалопатии. Для этого используют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Это средство в дозе 125 мкг/кг вводят подкожно 1 раз в день в течение 1-5 дней. При этом энцефалопатию моделируют гипоксией или внутрибрюшинным введением раствора солянокислого фенилгидразина. Предлагаемый способ позволяет эффективно проводить коррекцию нарушений эритропоэза за счет нейропротективного действия и предотвращения повреждения коммитированных клеток-предшественников эритропоэза. 3 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”MEDICA nova, (terramedica.spb.ru/l_2000/voltchek02.htm 13.08.2003) [16.06.2006] POSPISIL M. et al. “Pretreatment with granulocyte colony-stimulating factor reduces myelopoiesis in irradiated mice”. Radiat Res. 1999 Mar; 151(3):363-7. VAHDAT L. et al. “Rapidly cycled courses of high-dose alkylating agents supported by filgrastim and peripheral blood progenitor cells in patients with metastatic breast cancer”. Clin Cancer Res. 1995 Nov; 1(11):1267-73.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и касается способа коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при энцефалопатии.

Известны способы коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при моделировании гипоксии, сопровождающейся развитием энцефалопатии, с помощью оксибутирата натрия, вводимого сразу после воздействия в наркотической дозе 750 мг/кг [1] и с помощью неселективного бета-адреноблокатора – пропранолола [2].

Недостатком способа коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при моделировании гипоксической энцефалопатии, с помощью оксибутирата натрия является его низкая эффективность в случае отсроченного применения данного препарата, когда развитие гипоксической энцефалопатии (а нарушения в системе крови связаны именно с энцефалопатией [1]) предотвратить уже невозможно, а в клинической практике далеко не всегда является возможным проведение лечебных мероприятий сразу после гипоксической травмы [3].

Недостатком способа коррекции нарушений эритропоэза, сопровождающих энцефалопатию, с помощью пропранолола является факт отсутствия значимого влияния данного препарата на непосредственную причину развития нарушений в системе крови – поражение структур ЦНС. В связи с чем способ эффективен только при постоянном приеме препарата.

Данный способ (с помощью пропранолола) является наиболее близким к заявляемому по достигаемому результату и выбран в качестве способа прототипа.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности предлагаемого способа.

Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой коррекцию нарушений эритропоэза, заключающимся в подкожном введении лабораторным животным (мыши) после моделирования энцефалопатии препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день, в течение 1-5 дней.

Новым в предлагаемом изобретении является использование препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, вводимого в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день, в течение 1-5 дней.

Повреждение головного мозга при воздействии различных болезнетворных факторов зачастую сопровождается расстройствами функционирования органов и систем, подчиненных регуляторному влиянию тех структур центральной нервной системы, которые ответственны за их деятельность и которые существенно “пострадали” в результате воздействия. Таким образом, поражение структур ЦНС, ответственных за управление деятельностью внутренних органов и систем, способно приводить к развитию дизрегуляторной патологии висцеральных органов после воздействия [4].

Система крови играет одну из ключевых ролей в поддержании гомеостаза и формировании адекватных компенсаторно-приспособительных реакций организма при воздействии болезнетворных факторов. В то же время известно, что развитие энцефалопатии при гипоксических воздействиях вызывает дизадаптацию гемопоэтической ткани, проявляющуюся в повреждении кроветворных прекурсоров, снижении уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения и продукции патологических форм эритроцитов, что существенно ухудшает окислительное обеспечение тканей организма, перенесшего терминальное состояние [1, 5].

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) является линейно рестриктивным гемопоэтическим фактором с его основным специфическим гранулоцитопоэз-стимулирующим действием [6]. При этом сведений о существенном стимулирующем влиянии данного цитокина на эритропоэз нет. В то же время известно, что Г-КСФ обладает выраженным нейропротективным действием и способен положительно влиять на психоневрологический статус при энцефалопатии различного генеза [7]. Однако факт применения препарата Г-КСФ с целью коррекции нарушений эритропоэза для специалиста не является очевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты. При этом в предварительных экспериментах было выявлено, что доза 125 мкг/кг гранулоцитарного колониестимулирующего фактора является оптимальной и эффективна даже при однократном введении препарата. В то же время увеличение кратности введения Г-КСФ до 5 раз (1 раз в день, 5 дней) повышает эффективность способа максимально.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют эффективно коррегировать нарушения эритропоэза при энцефалопатии, и предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: “Новизна”, “Изобретательский уровень”, “Промышленная применимость”.

Способ осуществляют следующим образом.

Лабораторному животному (мыши) после моделирования энцефалопатии 1 раз в день подкожно вводили по 125 мкг/кг в течение 1-5 дней препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рч Г-КСФ).

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 278 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

На 3, 5, 7, 10-е сут определяли показатели периферической крови с помощью автоматического гематологического анализатора ABACUS (Diatron, Австрия) в ветеринарном режиме, костномозгового кроветворения стандартными гематологическими методами, содержание эритроидных клеток-предшественников (КОЕ-Э) в костном мозге, их пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки [8]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1.

Гипоксическая энцефалопатия моделировалась с помощью гермокамеры объемом 500 мл. Мыши помещались в гермокамеру, крышка закрывалась, и мыши оставались там до агонального судорожного припадка или остановки дыхания, определяемой визуально, в течение 10-15 секунд. После извлечения из гермокамеры и восстановления самостоятельного дыхания, через 5-10 минут, мыши вновь помещались в гермокамеру также до наступления агонального состояния (генерализованного судорожного припадка или остановки дыхания) [5]. Контрольной группе животных по схеме способа прототипа однократно подкожно на 2-е сут после воздействия вводили пропранолол (“Arzneimittelwerk”, Германия) в дозе 5 мг/кг. Опытным животным на 2-е сут после моделирования гипоксии подкожно однократно вводили 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ) – нейпоген (“Hoffinan-la Roche”, Швейцария) – в эквивалентном объеме растворителя (0,2 мл).

В ходе эксперимента введение пропранолола на 2-е сут после воздействия приводило к увеличению в периферической крови числа эритроцитов (7-е сут), содержания гемоглобина (5-е сут) и отмене развития гипохромной анемии. Указанные изменения со стороны периферической крови явились закономерным отражением динамики костномозгового эритропоэза. Отмечалось увеличение количества эритрокариоцитов в костном мозге на 5-е сут опыта, связанное с повышением содержания эритроидных прекурсоров (5-е сут) в гемопоэтической ткани, и ускорение темпа их деления на 3-е сут исследования.

Назначение рчГ-КСФ в те же сроки после воздействия сопровождалось значительно более существенным и продолжительным увеличением количества эритроцитов (7, 10-е сут), содержания гемоглобина (5, 7, 10-е сут) в периферической крови, числа эритроидных ядросодержащих клеток (5, 10-е сут) и КОЕ-Э в костном мозге (5, 7, 10-е сут) на фоне ускорения деления прекурсоров эритропоэза на 3, 5, 7-е сут опыта (табл.1).

Пример 2.

Энцефалопатия моделировалась на мышах линии CBA/CaLac, массой 18-20 г путем однократного внутрибрюшинного введения раствора соляно-кислого фенилгидразина в дозе 150 мг/кг [9]. Контрольной группе животных по схеме способа прототипа подкожно на 1-3-е сут после воздействия вводили пропранолол (“Arzneimittelwerk”, Германия) в дозе 5 мг/кг. Опытным животным в те же сроки подкожно вводили в дозе 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ) – нейпоген (“Hoffman-la Roche”, Швейцария).

Проведенные исследования показали, что введение пропранолола приводило к достоверным, но незначительным изменениям со стороны системы эритрона. Отмечалось повышение количества эритроцитов и гематокрита на 7, 10-е сут наблюдения. Со стороны костномозгового кроветворения имело место повышение уровня гиперплазии эритроидного ростка на 5-е сут опыта в результате повышения содержания колониеобразующих единиц эритропоэза (3-е сут) в костном мозге.

При введении препарата рчГ-КСФ увеличение количества эритроцитов и гематокрита также регистрировалось на 7, 10-е сут, а числа эритрокариоцитов в костном мозге на 5, 7, 10-е сут. При этом имело место возрастание содержания КОЕ-Э в гемопоэтической ткани на 5, 7, 10-е сут эксперимента, связанное с повышением их пролиферативной активности (табл.2).

Пример 3.

Энцефалопатию моделировали у мышей линии CBA/CaLac, массой 18-20 г, путем пункции ретроорбитального синуса и выпускания через промытую раствором гепарина пастеровскую пипетку в течение 3-х часов дробно, за 3 раза, 70% объема циркулирующей крови. Расчет необходимого для забора количества крови производят из предположения, что у грызунов объем циркулирующей крови составляет 1/13 часть от массы тела животного [10]. Контрольной группе животных по схеме способа прототипа подкожно с 1 по 5-е сут после воздействия вводили пропранолол (“Arzneunittelwerk”, Германия) по 5 мг/кг. Опытным животным в те же сроки подкожно вводили в дозе 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ) – нейпоген (“Hoffinan-la Roche”, Швейцария).

Введение пропранолола повышало количество эритроцитов на 5, 7, 10-е сут и гематокрит на 5-е сут наблюдения. При этом в костном мозге имело место увеличение количества эритрокариоцитов в костном мозге на 5, 7-е сут опыта по сравнению с животными, которым активность адренергических механизмов не коррегировалась. Культуральные методы исследования механизмов развития описанных феноменов выявили возрастание числа КОЕ-Э в костном мозге на 3, 7-е сут наблюдения.

Курсовое введение рчГ-КСФ увеличивало количество эритроцитов и гематокрит на 5, 7, 10-е сут после воздействия. Повышение количества эритрокариоцитов в костном мозге регистрировалось на 5, 7, 10-е сут опыта, причем изменения данного параметра значительно превосходили аналогичные значения в группе животных, леченных по способу-прототипу. Описанные изменения явились следствием возрастания пролиферативной активности КОЕ-Э и увеличения их содержания в костномозговой ткани практически во все сроки наблюдения (табл.3).

Таким образом, введение препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при моделировании энцефалопатии приводило к повышению содержания прекурсоров эритропоэза в гемопоэтической ткани, возрастанию уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения и увеличению количества эритроцитов в периферической крови. По всем показателям “положительный” эффект рчГ-КСФ превосходил эффект коррекции нарушений эритропоэза по способу-прототипу. При этом механизмом действия препарата, очевидно, являлось его нейропротективное действие [7] и предотвращение повреждения коммитированных клеток-предшественников эритропоэза в результате отмены дизрегуляции системы крови.

Предлагаемый способ позволяет эффективно проводить коррекцию нарушений эритропоэза, развивающихся при энцефалопатии различного генеза.

Цитируемая литература

1. Зюзьков Г.Н. Механизмы регуляции гемопоэза в постгипоксическом периоде: Дисс… канд. мед. наук. – Томск, 2003. – 158 с.

3. Алексеева Г.В., Гурвич А.М., Семченко В.В. Постреанимационная энцефалопатия (патогенез, клиника, профилактика и лечение). – Омск; Омская областная типография, 2003.-152 с.

4. Дизрегуляционная патология. / Под ред. Г.Н.Крыжановского. – М.: Медицина, 2002. – 652 с.

5. Патент РФ на изобретение №2240604 “Способ моделирования постгипоксической энцефалопатии и связанных с ней нарушений в системе крови”.

6. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения при цитостатических миелосупрессиях. – Томск, 1999. – 114 с.

8. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. – Томск: Изд-во ТГУ, 1992. – 264 с.

9. Патент РФ на изобретение №2253152 “Способ моделирования гипоксической энцефалопатии”.

10. Патент РФ на изобретение №2257620 “Способ моделирования постгеморрагической энцефалопатии”.

Формула изобретения

Способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной энцефалопатии путем введения препарата, отличающийся тем, что энцефалопатию моделируют гипоксией или внутрибрюшинным введением раствора солянокислого фенилгидразина, а для коррекции нарушений эритропоэза в качестве препарата используют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, который вводят подкожно после моделирования энцефалопатии в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день в течение 1-5 дней.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 29.09.2007

Извещение опубликовано: 20.05.2009 БИ: 14/2009