Патент на изобретение №2302633

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕФРОСКЛЕРОЗА У ДЕТЕЙ С ХРОНИЧЕСКИМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТОМ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики степени склерозирования почечной ткани при хроническом гломерулонефрите у детей, и может быть использовано в нефрологии и педиатрии. Сущность способа: в суточной моче детей с хроническим гломерулонефритом иммуноферментным методом определяют содержание интерлейкина-10, дополнительно определяют содержание трансформирующего фактора роста ₁ и вычисляют просклеротический коэффициент как соотношение концентраций трансформирующего фактора роста ₁ и интерлейкина-10. При значении коэффициента меньше 0,95 диагностируют умеренный компенсированный нефросклероз, а при его значении более 3,0 диагностируют выраженный необратимый нефросклероз. Применение способа дает возможность ранней диагностики степени выраженности нефросклероза у больных с хроническими формами патологии почек, что обеспечивает своевременную диагностику прогрессирования нефросклероза без использования биопсии почки.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”et al. Clinical significance of urinary interleukin-6 in children with reflux nephropathy. J. Urol. 2001, Jan.,165(1), p.210-214, реф. Найдено из БД PubMed, PMID: 11125408. [Найдено 08.08.2006]. [он лайн]. DE MURO P. et al.Urinary transforming growth factor-beta 1 in various types of nephropathy. Pharmacol. Res. 2004, Mar., 49(3), p.293-298, реф. Найдено из БД PubMed, PMID: 14726227 [Найдено 08.08.2006]. [он лайн].

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики степени склерозирования почечной ткани при хроническом гломерулонефрите у детей, и может быть использовано в нефрологии и педиатрии.

Нефросклероз – (nephrosclerosis: нефро + склероз) – замещение паренхимы почек соединительной тканью, приводящее к их уплотнению, сморщиванию и нарушению функций (Энциклопедический словарь медицинских терминов. – М., 1983. – Т.2. – С.236).

При выраженном диффузном склерозировании почечной ткани формируется резистентность к патогенетической терапии хронического гломерулонефрита и существенно ускоряется прогрессирование хронической почечной недостаточности, которое определяется по динамике клинических и гистологических нарушений ткани почек (Ратнер М.Я., Стенина И.И., Федорова Н.Д. Прогнозирование ускоренного прогрессирования хронического гломерулонефрита на основании клинических и гистоморфологических данных. – Тер. архив. – 1999. – №6. – С.27-30).

Диагностика нефросклероза основывается преимущественно на результатах гистоморфологического исследования почечной ткани (нефробиопсии) (Ратнер М.Я., Федорова Н.Д., Макуров А.И. Тубулоинтерстициальные изменения при различных клинических и морфологических типах хронического гломерулонефрита. – Урология и нефрология. – 1997. – №2. – С.16-19; Ратнер М.Я., Федорова Н.Д. Гистоморфологические Тубулоинтерстициальные изменения при прогрессировании хронического гломерулонефрита. – Урология. – 2000. – №1. – С.28-30). Указанный способ достаточно точен, однако, как любое инвазивное исследование, сопряжен с множеством технических трудностей, опасен и травматичен для больного.

Кроме нефробиопсии с целью диагностики нефросклероза используется изучение уровня фибронектина в моче (Козловская Л.В., Бобкова И.Н., Варшавский В.А., Проскурнева Е.П., Мирошниченко Н.Г., Чеботарева Н.В., Мухин Н.А. Фибронектин мочи как показатель процессов фиброзирования в почке при нефрите. – Тер. архив. – 1999. – №6. – С.34-38). Однако в последние годы было установлено, что указанный гликопротеид обнаруживается главным образом при диффузном нефросклерозе, тогда как при очаговом поражении почечной ткани выделяется лишь в 48% случаев, что существенно снижает его диагностическое значение (Сергеева Т.В., Алексеевских Ю.Г. и др. Характер и значение тубулоинтерстициальных изменений при первичном гломерулонефрите у детей. – Педиатрия. – 1997. – №2. – С.49-52).

Недостатками этих способов являются инвазивность и лучевая нагрузка на растущий организм ребенка. Указанные недостатки не позволяют использовать указанные диагностические процедуры для длительного динамического наблюдения за функциональным состоянием почек.

Известен способ диагностики нефросклероза путем ультразвукового сканирования почек с цветной допплерографией почечных сосудов. При нефросклерозе отмечается уменьшение размеров почек, фрагментарное истончение почечной паренхимы, нарушение кортико-медуллярной дифференцировки и деформация контура почки. Определяется неравномерное повышение эхогенности паренхимы, преимущественно в зоне ее истончения. В этих же местах выявляется обеднение интраренального сосудистого рисунка. Обнаруженные изменения почечной ткани расцениваются как нефросклероз.

Недостатком этого способа является значительная доля субъективизма при интерпретации полученных данных и малая чувствительность метода у больных с большой массой тела, что существенно снижает точность диагностики нефросклероза у подростков и взрослых.

Вместе с тем известно, что тубулоинтерстициальные нарушения значительно быстрее приводят к недостаточности почечных функций, чем гломерулосклероз. Развитие интерстициального нефросклероза проходит несколько стадий: воспаление, пролиферацию интерстициальных фибробластов, распространение интерстициального внеклеточного матрикса, приводящее к фиброзу (Eddy A.A. Molecular basis of renal fibrosis. – Pediatr Nephrol. – 2000. – Vol.15, №3-4. – P.290-301). Инфильтрация гломерул и интерстиция мононуклеарами считается наиболее серьезным поражением почечной ткани и главным образом влияет на исход необратимых структурных изменений в почках. При этом установлено участие цитокинов в развитии воспаления почек и нефросклероза у детей (Rovin В. Chemokines as therapeutic targets in renal inflammation. – Am J Kidney Dis. – 1999: V.34(4). – P.761-767).

Цитокины представляют собой биологически активные соединения, способствующие возникновению воспалительной реакции и влияющие на процессы клеточной пролиферации в почечной ткани. Наиболее значимыми из них являются интерлейкины (ИЛ)-6, -10 и фактор некроза опухоли- (ФНО), который считается провоспалительным цитокином.

При этом ИЛ-10 относится к группе противовоспалительных факторов и может рассматриваться как антагонист некоторых цитокинов, так как подавляет секрецию активированными моноцитами ИЛ-6 и ФНО.

В настоящее время установлено, что в развитии гломерулосклероза основную функцию выполняют мезангиальные клетки. Выявлена тесная взаимосвязь между ангиотензином-2 (ANG-2) и таким цитокином, как трансформирующий фактор роста-₁ (TGF-₁), в регуляции накопления мезангия (Border WA, Noble NA. Interactions of transforming growth factor- and angiotensin II in renal fibrosis. Hypertension. – 1998; V.31: P.181-188). При этом показано, что нарастание и фиброгенез мезангиального матрикса, в основном, регулируется TGF-₁, который стимулирует пролиферацию фибробластов (Schnaper H.W., Hayashida Т., Hubchak S.C., Poncelet A.C. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. – Am. J Physiol. Renal Physiol. – 2003; Vol.284(2). – P.243-252).

Эти данные свидетельствуют о возможности определения цитокинов как локальных медиаторов, образованных непосредственно в почке, для диагностики степени нефросклероза. При этом для оценки выраженности нефросклероза и интенсивности процессов клеточной пролиферации в почках особую ценность представляют методы определения способности почек продуцировать противовоспалительные цитокины и факторы роста в мочу. Однако до настоящего времени не использовалось комплексное определение взаимосвязанных противовоспалительных цитокинов и факторов роста в динамике развития нефросклероза при гломерулонефрите у детей.

Известен способ ранней диагностики нефросклероза путем выявления рефлюкс-нефропатии у детей с хроническим пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточникового рефлюкса, включающий иммуноферментный анализ суточной мочи на содержание цитокинов, отличающийся тем, что определяют содержание интерлейкина-8 (ИЛ-8), интерлейкина-10 (ИЛ-10) и фактора некроза опухоли (ФНО ) при первичном обследовании и через 6 месяцев, и при уменьшении содержания ИЛ-10 более чем в 1,3 раза и повышении содержания ФНО- более чем в 1,4 раза по сравнению с первоначальными значениями, на фоне постоянной концентрации ИЛ-8 диагностируют рефлюкс-нефропатию у больных с пузырно-мочеточниковым рефлюксом (Патент РФ №2239838, зарегистрированный 10.11.2004 г. “Способ диагностики рефлюкс-нефропатии”).

Этот способ диагностики избран нами в качестве прототипа.

Задачей данного изобретения является разработка неинвазивного информативного способа ранней диагностики нефросклероза у больных до появления рентгенологических, радиологических и эхографических признаков поражение почек.

Поставленная задача решается тем, что проводят иммуноферментный анализ суточной мочи на содержание интерлейкина-10, затем определяют содержание трансформирующего фактора роста ₁ и рассчитывают просклеротический коэффициент как соотношение концентраций трансформирующего фактора роста ₁ и интерлейкина-10 и при значении коэффициента меньше 0,95 диагностируют умеренный компенсированный нефросклероз, а при значении более 3,0 диагностируют выраженный необратимый нефросклероз.

Существенным отличием заявляемого способа от известных является то, что в качестве диагностического критерия нефросклероза рассчитывается просклеротический коэффициент как соотношение концентраций трансформирующего фактора роста (TGF-₁) и интерлейкина-10 (ИЛ-10), указывающих на развитие склеротических процессов в почечной паренхиме вследствие дисбаланса этих регуляторов.

В качестве исследуемого материала используют суточную мочу, в которой иммуноферментным методом определяют концентрации трансформирующего фактора роста ₁ и интерлейкина-10.

Способ не требует длительного наблюдения за больным, не сопряжен с осложнениями, связанными с инвазивными методами диагностики, и в то же время является высокоинформативным, так как отражает соотношение просклеротического и противовоспалительного (протективного в отношении ренальной ткани) факторов как локальных медиаторов, образованных непосредственно в почечной ткани.

Способ осуществляется следующим образом. У больных проводится сбор мочи на общем режиме в течение суток; затем осуществляется забор образцов для исследования, объемом 15 мл каждый, из общего объема суточной мочи после регистрации суточного диуреза. Образцы мочи до проведения анализа хранятся при -20°С.

Для измерения уровней изучаемых цитокинов используются коммерческие наборы: “CYTELISA-IL-10” (CYTIMMUNE, USA), “TGF-₁ ELISA” (BCM DIAGNOSTIC, USA). Применение их основано на методе твердофазного энзим-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay), принцип которого заключается в качественном и количественном определении изучаемого антигена путем его послойного связывания со специфичными к нему антителами. Моноклональные антитела, специфичные к исследуемому антигену, фиксированы на поверхности лунок 96-луночной планшетки. При добавлении к ним изучаемых образцов или стандартов исследуемый антиген связывается иммобилизованными антителами. После удаления методом отмывания не связавшихся протеинов, в лунки добавляются поликлональные антитела, связанные с энзимом. Они наслаиваются на иммобилизованный в ходе первой инкубации антиген по принципу “сэндвича”. После этого их излишек отмывается и в лунки добавляется раствор хромогенного субстрата, который прореагировав с энзимом, дает характерное окрашивание. По интенсивности последнего оценивается содержание в пробе исследуемого антигена.

Примеры конкретного осуществления способа.

Для оценки диагностической значимости способа нами проведены клинические и лабораторные исследования у 20 детей в возрасте 7-14 лет, из них 15 больных с хроническим гломерулонефритом, находившихся в нефрологическом отделении НИИ педиатрии ГУ НЦЗД РАМН, и 10 практически здоровых детей референтной группы (контроль). При этом у здоровых детей содержание трансформирующего фактора роста-₁ в суточной моче составило 23,86±3,27 пг/мл, а уровни интерлейкина-10 составили 19,48±5,58 пг/мл, соотношение концентраций указанных цитокинов составило 1,00±0,12. Эти данные использованы нами как референтные значения концентраций названных цитокинов в суточной моче.

Концентрации трансформирующего фактора роста-₁ и интерлейкина-10 в суточной моче сопоставляли с гистологическими критериями степени формирования нефросклероза, которые определялись по данным пункционной нефробиопсии в соответствии с классификацией Ставской В.В. (Ставская В.В., Рябов С.И., Клемина И.К. О клиническом значении тубулоинтерстициальных изменений при хроническом гломерулонефрите. – Клин. мед. – 1987. – №10. – С.125-129).

При этом было обнаружено существенное повышение уровней ТФР-₁ и снижение концентраций ИЛ-10 в суточной моче по мере возрастания степени повреждения почечной ткани, что сопровождалось изменениями коэффициента соотношений концентраций указанных цитокинов.

При вычислении соотношения уровней трансформирующего фактора роста-₁ и интерлейкина-10 (просклеротического коэффициента) в моче у больных с различной степенью нефросклероза установлено, что при умеренно выраженном повреждении почечной ткани этот показатель не превышал 0,95, тогда как при выраженном нефросклерозе возрастал более 3,0.

Пример №1. Больная Н. 12 лет (история болезни 2111/04) с диагнозом хронический гломерулонефрит, смешанная форма, активная стадия, ограничение функции почек по осмотическому концентрированию. Девочка больна в течение 6 лет. Заболевание проявляется стероидрезистентным нефротическим синдромом в сочетании с гематурией и артериальной гипертензией. В клинике проведена нефробиопсия, выявившая фокально-сегментарный гломерулосклероз с умеренными изменениями тубулоинтерстициальной ткани (умеренный нефросклероз). Уровень трансформирующего фактора роста-₁ в моче составил 33,5 пг/мл, содержание интерлейкина-10 – 40,7 пг/мл, соотношение концентраций (просклеротический коэффициент) – 0,82. Таким образом, снижение соотношения концентраций трансформирующего фактора роста-₁ и интерлейкина-10 в суточной моче за счет существенного увеличения уровней ИЛ-10 при неизменном по сравнению с контролем содержании ТФР-₁ свидетельствует об умеренном развитии нефросклероза у этой больной, что было подтверждено данными гистологического исследования нефробиоптата, при котором были выявлены обратимые, преимущественно локальные изменения тубулоинтерстициальной ткани почек.

Пример №2. Больная Р. 11 лет (история болезни 2131/04) с диагнозом хронический гломерулонефрит, смешанная форма, активная стадия, ограничение функции почек по осмотическому концентрированию. Девочка больна в течение 7 лет. Заболевание проявляется стероидрезистентным нефротическим синдромом в сочетании с гематурией и артериальной гипертензией. В клинике в возрасте 11 лет проведена нефробиопсия, выявившая фокально-сегментарный гломерулосклероз с выраженными изменениями тубулоинтерстициальной ткани и формированием склеротических изменений (выраженный нефросклероз). Уровень трансформирующего фактора роста-₁ в моче составил 35,6 пг/мл, содержание интерлейкина-10 – 10,4 пг/мл, соотношение концентраций этих веществ (просклеротический коэффициент) – 3,4. В данном случае повышение соотношения концентраций трансформирующего фактора роста-₁ и интерлейкина-10 в суточной моче за счет существенного увеличения уровней ТФР-₁ и значимого уменьшения содержания ИЛ-10 по сравнению с контролем свидетельствует о формировании выраженного нефросклероза у этой больной, что подтверждено данными гистологического исследования нефробиоптата.

Пример №3. Больная Р. 14 лет (история болезни 2156/04) с диагнозом хронический гломерулонефрит, смешанная форма, активная стадия, ограничение функции почек по осмотическому концентрированию. Девочка больна в течение 9 лет. Заболевание проявляется стероидрезистентным нефротическим синдромом в сочетании с гематурией и артериальной гипертензией. В клинике в возрасте 14 лет проведена нефробиопсия, выявившая распространенный фокально-сегментарный гломерулосклероз с резко выраженными изменениями тубулоинтерстициальной ткани и обширным формированием склеротических изменений (выраженный необратимый нефросклероз). Уровень трансформирующего фактора роста-₁ в моче составил 49,8 пг/мл, содержание интерлейкина-10 – 5,9 пг/мл, соотношение концентраций этих веществ (просклеротический коэффициент) – 8,3. В данном случае значительное повышение соотношения концентраций трансформирующего фактора роста-₁ и интерлейкина-10 в суточной моче за счет существенного увеличения уровней ТФР-₁ и значимого уменьшения содержания ИЛ-10 по сравнению с контролем свидетельствует о формировании выраженного необратимого нефросклероза у этой больной, что подтверждено данными гистологического исследования нефробиоптата.

Таким образом, выявленные изменения соотношений концентраций трансформирующего фактора роста-₁ и противовоспалительного интерлейкина-10 как диагностического просклеротического коэффициента могут быть использованы в качестве информативного критерия степени выраженности нефросклероза у больных с хроническими формами патологии почек. Это обеспечит своевременную диагностику прогрессирования нефросклероза без использования биопсии почки.

Предложенный способ является неинвазивным и информативным и позволяет сократить сроки пребывания больных в стационаре, а также уменьшить количество осложнений от других методов обследования.

Формула изобретения

Способ диагностики нефросклероза у детей с хроническим гломерулонефритом, включающий иммуноферментный анализ суточной мочи на содержание интерлейкина-10, отличающийся тем, что дополнительно определяют содержание трансформирующего фактора роста ₁ и рассчитывают просклеротический коэффициент как соотношение концентраций трансформирующего фактора роста ₁ и интерлейкина-10 и при значении коэффициента меньше 0,95 диагностируют умеренный компенсированный нефросклероз, а при значении более 3,0 диагностируют выраженный необратимый нефросклероз.