Патент на изобретение №2301682

(54) ВАКЦИНА ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ХЛАМИДИОЗА КРУПНОГО И МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Вакцина содержит инактивированные хламидийные очищенные антигены из штаммов вида Chlamydia psittaci: М3-89 – возбудителя хламидиозного менингоэнцефалита телят, 250 – возбудителя хламидиозного аборта коров и СК-89 – возбудителя хламидиозного конъюнктивита телят, выращенные одновременно в желточной и аллантоисной оболочках куриных эмбрионов и взятые в соотношении 0,25:0,25:0,5 соответственно с концентрацией хламидий 16-18 мг/мл, адсорбированных на алюмокалиевых квасцах и эмульгированных в масляно-ланолиновом адъюванте, с содержанием 0,2% глутарового альдегида в качестве консерванта. Вакцина обладает высокой иммуногенной активностью с широким спектром антигенности при различных клинических формах заболеваний крупного и мелкого рогатого скота. 9 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к производству вакцины для специфической профилактики хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота, этиологическим агентом которого является Chlamydia psittaci.

Хламидиозы крупного и мелкого рогатого скота – инфекционная болезнь, протекающая в виде абортов, рождения мертвых плодов или слабого потомства, уретритов, орхитов, баланопоститов, простатитов, семенного везикулита, гастроэнтероколита, полиартрита, бронхопневмоний, конъюнктивитов, энцефаломиелитов и других синдромов.

Для хламидиозной инфекции в целом характерна слабая иммунологическая реакция, тенденция к хроническому и латентному течению с сохранением возбудителя в организме даже после острого переболевания и клинического выздоровления. (Хламидиозы сельскохозяйственных животных. М., “Колос”, 1984. – С.71-76).

В нашей стране известна выпускаемая биологической промышленностью “Инактивированная эмульсин-вакцина против хламидиозного аборта овец”. Авторы Ю.Д.Караваев, Н.И.Налетов (Авторское свидетельство СССР №692128, Кл. А61К 39, 1977) рекомендовали данную вакцину для специфической профилактики хламидиоза овец и крупного рогатого скота, однако ее применение не привело к ощутимым результатам (Тр. института ВИЭВ. – 1981. – №53. – С.95-102).Наиболее близким аналогом по сущности к предлагаемому изобретению (прототип) является “Вакцина против хламидиоза сельскохозяйственных животных”, содержащая в качестве антигена возбудитель хламидиозного аборта крупного рогатого скота, выращенный в желточной оболочке куриных эмбрионов, инактивированный мертиолятом, а в качестве адъюванта служат раствор тригидрооксиметиламинометана и тетраметилдиамина, раствор акриламинда и метилбисакриламида, раствор персульфата аммония и раствор глутарового альдегида (см. авт. свид. №826744 “Вакцина против хламидиоза сельскохозяйственных животных”, кл. С12 N5/00 за 1984 г.).

Состав вакцины, взятый в качестве прототипа, следующий (мл):

Задачей изобретения является получение вакцины, обладающего высокой иммуногенной активностью с широким спектром антигенности при различных клинических формах заболевания крупного и мелкого рогатого скота.

Поставленная задача достигается тем, что вакцина для специфической профилактики хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота содержит инактивированные и очищенные хламидийные антигены из штаммов хламидий вида Chlamydia psittaci: “М3-89” – возбудителя хламидиозного менингоэнцефалита телят, “250” – возбудителя хламидиозного аборта коров и “СК-89” – возбудителя хламидиозного конъюнктивита телят, выращенных одновременно в желточной и аллантоисной оболочках куриных эмбрионов, взятых в соотношении 0,25; 0,25; 0,5 соответственно и с концентрацией 16-18 мг/мл, адсорбированных на алюмокалиевых квасцах и эмульгированных в масляно-ланолиновом адъюванте, с содержанием 0,2% глутарового альдегида в качестве консерванта, со следующим составом вакцины (мл):

Входящие в вакцину штаммы хламидий “М3-89”, “250”, “СК-89” нами изысканы, депонированы и являются производственными.

Штамм “МЗ-89” – возбудитель менингоэнцефалита крупного рогатого скота выделен в 1989 году из мозга теленка, отнесен к порядку Chlamydiales, сем. Chlamydiaceae, роду Chlamydia, виду Chlamydia psittaci. Штамму присвоен регистрационный номер МЗ-89 ДЕП во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ). Штамм депонирован 26 апреля 2000 г.

Штамм “250” – возбудитель хламидиозного аборта коров выделен в 1970 г. от абортированного плода коровы, отнесен к порядку Chlamydiales, сем. Chlamydiaceae, роду Chlamydia, виду Chlamydia psittaci. Штамм возбудителя хламидиозного аборта коров депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ).

“СК-89” – возбудитель хламидиозного конъюнктивита крупного рогатого скота выделен в 1989 году из истечений глаз теленка с признаками конъюнктивита, отнесен к порядку Chlamydiales, сем. Chlamydiaceae, роду Chlamydia, виду Chlamydia psittaci. Штамму возбудителя хламидиозного конъюнктивита крупного рогатого скота присвоен регистрационный номер “СК-89”-ДЕП во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ). Штамм депонирован 26 апреля 2000 г.

Входящие в вакцину штаммы хламидии “МЗ-89”, “250”, “СК-89” обладают следующими свойствами:

– культивироваться в оболочке желточного мешка развивающегося куриного эмбриона 6-7 суточного и аллантоисной оболочке 8-9 суточного возраста;

– вызывают специфическую гибель куриных эмбрионов, инфицированных в желточную полость, в течение 4-8 суток после заражения и накапливаются в титре 10^-5,5-7,7 ЭЛД₅₀/0,3 мл;

– должны быть свободными от контаминации посторонними микроорганизмами;

– в мазках-отпечатках из желточной оболочки и мазках из аллантоисной жидкости должны просматриваться при исследовании под большим увеличением микроскопа элементарные тельца хламидии, окрашенные по Стэмпу в красный, по Романовскому-Гимза в темный цвет, располагающиеся вне и внутри клеток кокковидной формы, величиной 250-300 нм.

Антигенные свойства штаммов “МЗ-89”, “250” и “СК-89” изучали по способности индуцировать формирование антител у морских свинок при иммунизации гомологичным антигеном и путем выявления антител в иммунных хламидийных сыворотках, полученных к гомологичным и производственным штаммам хламидий “Ростиново-70” – возбудителя хламидиозного аборта овец, “Лори” – возбудителя хламидиоза птиц, а также стандартных диагностикумов, изготовленных в условиях лаборатории вирусологии ФГУ ФЦТРБ г.Казань. Работа выполнялась согласно “Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике хламидиозов сельскохозяйственных животных”, утвержденным Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России от 30 июня 1999 года.

Данные по изучению антигенных свойств штаммов хламидий “МЗ-89”, “250”и “СК-89” представлены в таблице 1.

Приведенные в таблице 1 данные показывают, что антигены из штаммов МЗ-89″, “250” и СК-89″ реагируют между собой в титрах на один и два порядка ниже, чем с гомологичными штаммами, что свидетельствует об их выраженном антигенном отличии и их принадлежности штаммов “МЗ-89”, “250”, СК-89″ к хламидиям.

Иммуногенные свойства штаммов хламидий: “МЗ-89”, “250”, “СК-89” изучали на белых мышах. С этой целью готовились очищенные, концентрированные и инактивированные препараты, которые двукратно, с интервалом 7 дней, вводили белым мышам в дозе 0,3-0,4 см³. Через 14 дней после иммунизации белых мышей искусственно заражали гомологичными и гетерологичными культурами хламидий. Результаты опытов приведены в таблице 2.

В экспериментальных опытах на белых мышах установили (таблица 2), что двукратная внутрибрюшинная иммунизация суспензиями на основе штаммов “МЗ-89”, “250” и “СК-89” предохраняет белых мышей от развития хламидиозной инфекции при искусственном заражении гомологичными штаммами. Так, от “МЗ-89” – 93%, “250” – 90%,”СК-89″ – 60% при гибели 80-92% интактных белых мышей. Таким образом, в опытах по изучению иммунногенных свойств штаммов “МЗ-89”, “СК-89”, “250” установили, что изготовленные на их основе препараты обеспечивают у привитых животных формирование напряженного иммунитета от заражения гомологичными и слабый – от гетерологичных штаммов.

Патогенные свойства штаммов хламидий: “МЗ-89”, “СК-89” и “250” для лабораторных животных, крупного и мелкого рогатого скота представлены в таблице 3.

При сравнительной оценке трех штаммов “МЗ-89”, “СК-89”, “250”, относящихся к одному виду Chl.psittaci, были выявлены существенные различия в вирулентности, иммуногенности и антигенности (таблица 3). Так, при интраназальном способе заражения белых мышей штаммом “МЗ-89” наблюдали гибель 60-90% белых мышей, а при подкожном и внутрибрюшинном способах – 40-70%. У штамма “СК-89” наибольшая гибель белых мышей наблюдалась при интраназальном способе заражения (90-100%) и более низкая при подкожном и внутрибрюшинном способах (40-50 и 80-90% соответственно). При заражении белых мышей штаммом “250” наибольшая гибель (80-97%) наблюдалась при интраназальном и внутрибрюшинном способах и наименьшая (30-40%) – при подкожном.

При заражении морских свинок штаммами “МЗ-89” и “250” все животные переболевали, тогда как при внутрибрюшинном и интраназальном способах заражения штаммом “СК-89” более 40-50% морских свинок из числа заболевших погибали от пневмонии.

Существенные различия в течение заболевания наблюдали при внутривенном заражении крупного рогатого скота штаммами “МЗ-89”, “250” и “СК-89”. Так, у животных, зараженных штаммом хламидий “МЗ-89”, в основном наблюдали признаки менингоэнцефалита, “СК-89” – конъюнктивита, а при заражении штаммом “250” – аборты.

На основании изучения биологических свойств штаммов “МЗ-89”, “250”, “СК-89” нами были установлены выраженные межштаммовые различия в вирулентности в отношении к экспериментальным и естественным животным.

Полученные данные при изучении иммунногенных свойств штаммов: “МЗ-89”, “СК-89” и “250” свидетельствуют о разной их иммуногенной активности и, как следствие, слабом иммунитете.

Таким образом, результаты по сравнительному изучению биологических свойств штаммов хламидий “МЗ-89”, “СК-89” и “250” показали, что выделенные штаммы значительно отличаются между собой, хотя и относятся к одному и тому же виду хламидий – Chl.psittaci. Полученные данные служили научной предпосылкой при конструировании полиштаммовой вакцины для специфической профилактики хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота.

Поэтому для повышения эффективности созданной противохламидиозной вакцины были взяты отличные друг от друга штаммы хламидий крупного рогатого скота: “МЗ-89” – возбудитель менингоэнцефалита телят, “СК-89” – возбудитель конъюнктивита телят, “250” – возбудитель хламидиозного аборта коров, тем самым добились значительного повышения иммуногенности вакцины за счет расширения спектра антигенности препарата, что является одним из отличительных признаков в созданной противохламидиозной вакцине от существующего прототипа.

Пример 1. Приготовление нативных суспензий хламидий.

Используют куриные эмбрионы 6-7 дневного возраста, половину которых заражают в желточную полость штаммами хламидий “250” и “МЗ-89”, вторую половину штаммом хламидий “СК-89” в разведении до 10^-4 в дозе 0,3 мл. Инфицированные эмбрионы инкубируют при 37-38°С в течение двух дней, затем проводят овоскопию, отбирают и уничтожают павшие (неспецифическая гибель), а живые эмбрионы заражают повторно в аллантоисную полость суспензией, разведенной до 10^-3 в дозе 0,3 мл соответственно штаммами “250”, “МЗ-89” и “СК-89”. Далее зараженные эмбрионы инкубируют при 37-38°С в течение 7-8 дней. Специфическая гибель 90-95% инфицированных эмбрионов происходит на 6-9 дни после первичного заражения. Павшие эмбрионы охлаждают и вскрывают. От каждого эмбриона отсасывают 4-5 мл хламидиосодержащей аллантоисной жидкости и отбирают 1-2 г хорион-аллантоисной и желточной оболочек вместе с сопутствующим желтком.

Хламидиосодержащий материал до использования хранят в замороженном при минус 20-30°С состоянии. Аллантоисную жидкость перед заморозкой осветляют центрифугированием при 3 тыс.об/мин в течение 30 минут.

Для получения полуфабриката вакцины из хламидиосодержащего материала трех штаммов готовят 10%-ную суспензию на фосфатно-буферном физиологическом растворе (ФСБ) рН 7,2-7,4 следующим образом: хламидиосодержащие оболочки взвешивают, подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию и суспендируют до 20%-ной концентрации на коллоидной мельнице, добавив расчетное количество ФБР. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут и отсасывают средний слой центрифугата – взвесь хламидий. Осадок тканей и верхний желточный слой удаляют. Замороженную хламидиосодержащую аллантоисную жидкость размораживают в водяной бане при температуре 37°С. Размороженную, слегка опалесцирующую аллантоисную жидкость разводят в соотношении 1:1 с ФБР.

Пример 2. Объединение штаммов хламидий и инактивация.

Хламидиосодержащие суспензии инфицированных оболочек и аллантоисной жидкости штаммов “МЗ-89”, “СК-89” и “250” объединяют и добавляют формальдегид в конечной концентрации 0,2-0,3%. Суспензию после добавления реагентов перемешивают и выдерживают в течение 48 часов при температуре 37-38°С для инактивации хламидий. Хламидии из инактивированной суспензии осаждают путем центрифугирования при 18-20 тыс.об/мин в течение 60 минут. Надосадочную жидкость вместе с верхним желточным слоем удаляют, осадок элементарных телец хламидий взвешивают и ресуспендируют в соотношении 1:25 с ФБР, содержащим 0,2-0,3% глутарового альдегида.

Стандартизацию суспензии по содержанию элементарных телец хламидий осуществляют путем определения ее оптической плотности. Для этого из приготовленной взвеси хламидий готовят разведение 1:10 (к 0,5 мл взвеси добавляют 4,5 мл ФБР) и измеряют коэффициент поглощения на ФЭК 56М при длине волны 540 нм в кюветах с рабочей длиной 10 нм. Оптимальным для получения иммунногенной вакцины является коэффициент поглощения, равный 1,8-2,0 единиц, что соответствует содержанию 16-18 мг антигена в одном мл суспензии.

Стандартизированную взвесь хламидий пропускают через коллоидную мельницу, добавляют алюмо-калиевые квасцы в конечной концентрации 0,4-0,5% и снова гомогенезируют в течение 5 минут, затем взвесь сливают в стеклянные баллоны и помещают в рефрижератор при 4-6°С на 1-2 суток. В этих условиях хламидии адсорбируются на алюмо-калиевых квасцах и осаждаются в виде хлопьев. Надосадочную жидкость отсасывают и удаляют, а осадок ресуспендируют до исходного объема фосфатно-буферным раствором, содержащим 0,2-0,3% глутарового альдегида. Полученные полуфабрикаты вакцины с консервантом хранят в рефрижераторе при 4-6°С.

Пример 3. Приготовление вакцины

Для изготовления 1000 мл вакцины берут: 514 мл инактивированного антигена штаммов (“МЗ-89”, “СК-89” и “250”), 4,0 мл 10% раствора алюмо-калиевых квасцов, 2,0 мл 10% раствора глутарового альдегида и добавляют 480 мл стерильной масло-ланолиновой смеси в соотношении 84:16. Пропускают через коллоидную мельницу и расфасовывают в стерильные флаконы по 100 мл.

При изменении минимума или максимума в соотношениях компонентов при изготовлении вакцины происходит расслоение эмульсии на водную и масляную фракции, что снижает иммуногенность вакцины.

Пример 4. Контроль вакцины на стерильность, безвредность и на антигенную и иммуногенную активность.

Контроль вакцины на стерильность, стойкость эмульсии и безвредность проводится по общепринятым методам.

Испытывалось 10 серий вакцины на лабораторных животных и телятах. Белых мышей массой 16-18 г вакцинировали внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл, морских свинок подкожно по 1,0 мл с последующим наблюдением за состоянием подопытных животных в течение 14 и 23 дней соответственно.

Падежа лабораторных животных после вакцинации в течение срока наблюдения не установлено. Общее состояние вакцинированных животных во всех сериях опытов было удовлетворительным. Испытуемые серии вакцины против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота были стерильны и безвредны (таблицы 4 и 5).

Контроль иммуногенности проводят на морских свинках. Животных вакцинируют в дозе 0,5 мл подкожно в области лопатки справа и слева (по 0,25 мл). Вакцинация способствует выработке специфических хламидийных антител на 30-35 день в титрах 1:5-1:80 (средний арифметический титр не ниже чем 1:20) (таблица 6).

Контроль иммуногенной активности вакцины против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота проводят на белых мышах. Мышей вакцинируют подкожно в дозе 0,2-0,3 мл. Контрольное заражение опытных и интактных животных проводят штаммами хламидий “МЗ-89”, “СК-89″ и 250” внутрибрюшинно в дозе 0,4 мл через 30 дней после иммунизации. Выживаемость белых мышей после контрольного заражения вирулентными культурами хламидий штаммом “МЗ-89”, “СК-89” и “250” колебалась в пределах 67-80% (М±м 73,3±4,3%) и 77-83% (М±м 80±2,4%), 70-85% (М±м 76,6±2,4%) соответственно. Средний процент выживаемости вакцинированных мышей после контрольного заражения составил 78,2±2,1% (таблица 7). В группах контрольных мышей после заражения отмечается 100% клиническое заболевание и гибель от 60 до 80% животных. Выживаемость интактных мышей после заражения штаммами хламидий “МЗ-89”, “СК-89”, “250” колеблется в пределах 13-39% (24±2,4%), 16-18% (17±1,4%) и 11-40% (26±1,6%) соответственно.

Испытание эффективности разработанной полиштаммовой вакцины в лабораторных условиях в остром опыте на телятах и овцах показало, что биопрепарат обладает иммуногенностью и вызывает у животных формирование иммунитета против возбудителей хламидиозного менингоэнцефалита, полиартрита, кератоконъюктивита и аборта коров, овец, что подтверждалось результатами клинических, серологических, микроскопических и вирусологических исследований (акты по испытанию полиштаммовой вакцины на телятах и овцах прикладываются).

Вакцину применяют с профилактической целью в неблагополучных по хламидиозу крупного и мелкого рогатого скота хозяйствах, племпредприятиях и в частном секторе. Вакцинируют клинически здоровых телят, коров, нетелей, быков-производителей различных половозрастных групп овец, находящихся на территории, неблагополучной по хламидиозу. Больных хламидиозом животных перед вакцинацией подвергают лечению антибиотиками тетрациклинового ряда и после клинического выздоровления вакцинируют против хламидиоза. Телят вакцинируют с 1-6 мес возраста, ревакцинируют через 6 мес в той же дозе. Телок случного возраста перед вакцинацией исследуют серологически на хламидиоз. Вакцинируют клинически здоровых и серонегативных животных перед осеменением и через 6 мес проводят ревакцинацию половиной прививочной дозы. Ягнят после окончания окотов вакцинируют однократно. Овцематок и ярок вакцинируют за 1-2 мес до осеменения или случки. Быков-производителей и баранов перед первичной вакцинацией исследуют серологически на хламидиоз. Вакцину вводят крупному и мелкому рогатому скоту строго внутримышечно в области верхней трети шеи, в дозах телятам в возрасте от 1 до 6 мес – 1,0 мл; телкам случного возраста, нетелям, коровам и быкам-производителям – 2,0 мл; ягнятам в возрасте от 1 до 3 мес – 0,5 мл; яркам, овцематкам и баранам-производителям – 1,0 мл. У вакцинированных животных на месте введения вакцины наблюдают местную реакцию в виде небольшой припухлости, которая исчезает в течение 2-4 недель. Иммунитет у привитых животных наступает через месяц после прививки и сохраняется в течение шести месяцев. Продукты убоя, полученные от вакцинированных животных, независимо от срока вакцинации, реализуют без ограничений. Срок годности вакцины 1 год.

Производственное испытание вакцины, изготовленной в лаборатории вирусологии ФГУ “ФЦТРБ” (г.Казань), проводили в животноводческих, овцеводческих хозяйствах зоны Среднего Поволжья РФ. Данные по вакцинации против хламидиоза крупного рогатого скота и овец в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах представлены в таблице 8, из которой следует, что в результате применения вакцины количество абортов и мертворождений среди коров, нетелей и овцематок, а также заболеваемость, падеж и вынужденный забой телят, ягнят от хламидиозной инфекции в этих хозяйствах сократились более чем в 2 раза.

За период 2000-2004 г. в ФГУ “ФЦТРБ” изготовлено более 137 тыс.доз вакцины против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота, которая используется в 165 неблагополучных по хламидиозу крупного и мелкого рогатого скота хозяйствах Российской Федерации (таблица 9). Опыты по широкому производственному испытанию разработанной нами вакцины крупного и мелкого рогатого скота инактивированной эмульсионной в различных регионах показали, что вакцина обладает высокой эффективностью и при систематическом использовании обеспечивает стабилизацию эпизоотической ситуации по хламидиозу и оздоровление в животноводческих и овцеводческих хозяйствах от хламидиозной инфекции.

Формула изобретения

Вакцина для специфической профилактики хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота, содержащая инактивированный антиген Chlamydia psittaci, адъювант и консервант, отличающаяся тем, что содержит инактивированные и очищенные хламидийные антигены из штаммов МЗ-89 – возбудителя хламидиозного менингоэнцефалита телят, 250 – возбудителя хламидиозного аборта коров и СК-89 – возбудителя хламидиозного конъюнктивита телят, выращенных одновременно в желточной и аллантоисной оболочках куриных эмбрионов, взятых в соотношении 0,25:0,25:0,5, соответственно, с концентрацией хламидий 16-18 мг/мл, адсорбированных на алюмокалиевых квасцах и эмульгированных в масляно-ланолиновом адъюванте, с содержанием 0,2% глутарового альдегида, в качестве консерванта.