Патент на изобретение №2301519

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ОДНОДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ IN VITRO

(57) Реферат:

Изобретение относится к культивированию тканей растений и может быть использовано в сельском хозяйстве, а также для проведения исследований в области физиологии растений. Семена однодольного растения обрабатывают в условиях вакуумной инфильтрации в течение 30-50 мин в суспензии штамма Agrobacterium tumefaciens GV3850, затем инкубируют в суспензии этого штамма в течение 23-25 часов. Проростки выращивают на твердой питательной среде в течение 3-5 суток без антибиотиков, в которую затем добавляют совместно канамицин и цефотаксим. Способ позволяет увеличить выход трансгенных однодольных растений независимо от морфогенетического потенциала и сомаклональной изменчивости и сократить сроки их получения. 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, городском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области биотехнологии, физиологии и экологии растений.

Недостатком данного метода является его низкая эффективность.

Недостатком данного способа является его применение только на арабидопсисе, который не является однодольным растением.

Недостатком данного метода трансформации является низкая частота получения трансгенных растений (от 0,3% до 3%), а также использование в качестве эксплантов незрелых зародышей, на которых впоследствии будет формироваться каллус. Общим недостатком для всех методов трансформации с применением каллусных культур является зависимость от морфогенетического потенциала растения; появление сомаклональных вариантов, в том числе и устойчивых к селективному агенту (канамицину); значительная продолжительность получения трансгенных растений – в вышеприведенной работе время от момента начала трансформации до появления трансгенных растений составляет не менее 8 месяцев.

Задачей настоящего изобретения является разработка такого способа, который будет лишен вышеуказанных недостатков и позволит получать трансгенные растения независимо от морфогенетического потенциала и сомаклональной изменчивости, а также сократит сроки получения генетически модифицированных растений.

Эта задача решается новым способом получения трансформированных однодольных растений, заключающимся в обработке семян в условиях вакуумной инфильтрации в суспензии штамма Agrobacterium tumefaciens GV3850, содержащего селективный ген nptII и целевой ген ipt, при этом суспензию Agrobacterium tumefaciens предварительно активизируют экстрактом из листьев табака, с последующим инкубированием эксплантов в суспензии Agrobacterium tumefaciens в условиях нормального давления при перемешивании, причем в качестве эксплантов используют семена, вакуумную инфильтрацию проводят при -0,7÷-0,9 атм в течение 30-50 минут, инкубацию семян в суспензии Agrobacterium tumefaciens проводят в течение 23-25 часов, выращивание проростков на твердой питательной среде проводят в течение 3-5 суток без антибиотиков с последующим совместным добавлением антибиотика канамицина (50 мг/л) – для отбора канамицин-устойчивых растений и цефотаксима (300 мг/л) – для элиминации агробактерии.

Используемый в работе штамм Agrobacterium tumefaciens любезно предоставлен профессором СПбГУ Лутовой Л.А., содержит плазмиду pGV3850 с геном ipt (изопентениладенин трансфераза – ключевой фермент биосинтеза цитокинина) под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты, и геном nptII, который кодирует фермент неомицинфосфотрансферазу, обеспечивающий устойчивость к канамицину для селекции растительных клеток под контролем NOS – промотора.

Заявляемые пределы режимов вакуумной инфильтрации определяются следующим образом: при использовании давления меньше -0,7 атм и обработке менее 30 минут снижается выход канамицин-устойчивых растений, а при повышении давления больше 0,9 атм и обработке более 50 минут снижается появление жизнеспособных растений. Заявляемые пределы совместной инкубации семян и суспензии агробактерии при перемешивании определяются следующим образом: инкубация менее 23 часов приводит к снижению выхода канамицин-устойчивых растений, более 25 часов приводит к сильному разрастанию агробактерии на поверхности семян при дальнейшем их совместном культивировании на твердой питательной среде и к невозможности прорастания большинства семян. Заявляемые пределы последующего совместного культивирования агробактерии и семян на твердой питательной среде без антибиотиков определяются следующим образом: инкубация семян менее 3 дней недостаточна для отбора канамицин-устойчивых растений, более 5 – приводит к гибели большинства проростков в связи с токсическим действием агробактерии.

Сущность изобретения, по мнению авторов, состоит в применении семян для трансформации однодольных, а также в модификации метода агробактериальной трансформации, заключающейся в сочетании нескольких способов: вакуумной инфильтрации эксплантов в суспензии агробактерии, совместным культивировании эксплантов и агробактерии, как в жидкой, так и на твердой питательной среде. Использование семян дает возможность избежать неконтролируемой сомаклональной изменчивости, позволяет получать трансгенные растения независимо от их морфогенетического потенциала, а также способствует сокращению сроков получения генетически модифицированных растений.

Кроме этого, полученные растения обладают более высокой жизнеспособностью по сравнению с регенерированными из каллусных культур.

Краткое описание фигур чертежей:

На фигурах 1 и 2 показан ПЦР-анализ ДНК растений пшеницы, прошедших вакуумную инфильтрацию в суспензии агробактерии при -0,8 атм, в течение 40 минут с последующим переводом на качалку (перемешиванием) в течение 23 часов, высаживанием на твердую питательную среду и культивированием в течение соответственно 3 и 5 суток без антибиотиков, затем добавляя антибиотики совместно в следующих концентрациях: цефотаксим – 300 мг/л – для элиминации Agrobacterium tumefaciens, канамицин – 50 мг/л – для отбора канамицин-устойчивых растений.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Семена пшеницы сорта «Энита» обрабатывают в суспензии Agrobacterium tumefaciens посредством вакуумной инфильтрации при -0,7 атм в течение 30 минут с последующим переводом на качалку (перемешиванием) в течение 23 часов, высаживанием на твердую питательную среду и культивированием в течение 3 суток без антибиотиков, затем добавляя антибиотики совместно в следующих концентрациях: цефотаксим – 300 мг/л для элиминации Agrobacterium tumefaciens, канамицин – 50 мг/л для отбора канамицин-устойчивых растений. Перед трансформацией суспензионную культуру Agrobacterium tumefaciens наращивают в течение 24 часов при +25°С на качалке с круговым вращением (амплитуда 5-10 см, скорость вращения 100 об/мин). После чего ее разбавляют жидкой питательной средой с содержанием макро- и микросолей по Мурасиге-Скуга с добавлением 120 мг/л аспарагина, 20 мг/л аскорбиновой кислоты, 100 мг/л мезо-инозита, без добавления гормонов (МС1). Перед трансформацией в суспензионную культуру агробактерии добавляют экстракт из листьев табака. Для приготовления экстракта табака листья пробирочных растений мелко измельчают, заливают жидкой питательной средой МС1 и выдерживают в течение 2 часов.

Выращивание агробактерии проводят при 26°С на агаризованной среде LB (бакто-триптон (пептон) – 10 г/л, бакто-дрожжевой экстракт – 5 г/л, NaCl – 10 г/л, агар-агар – 15 г/л, рН 7,5) с антибиотиками (300 мг/л стрептомицина и 100 мг/л карбеницеллина). При получении суспензионной культуры агар из среды исключают.

Из 100 мг молодых листьев. Для анализа трансгенных растений методом ПЦР применяют следующие пары праймеров TMR-1 5′-GGA-AGC-GGA-CGA-CCA-ACA-GTG-GAA-3′, TMR-2 5′-CTC-CTG-AGC-GAT-CCC-ATT-AAT-CAA-3′ (для гена ipt); NPT D 5′-GTC-GAG-AAG-GCT-ATT-CGG-CTA-3′, NPT-R 5′-CCA-CCA-TGA-TAT-TCG-GCA-AG-3′ (для гена nptII). Праймеры были изготовлены НПФ «Литех». Амплификацию проводят в программируемом термоцикле МС2 (ЗАО «ДНК-Технология», Москва). Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 67 мМ трис-HCl (рН 8,6), 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 2,5 мМ MgCl₂, 0,0025% Tween – 20; 0,0025% Np40, 0,0125% крезолового красного, 6,25% глицерина, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,25 мМ праймера, 2 ед. термостабильной Tag-ДНК-полимеразы (НПО «СИЛЕКС М», Москва), 30 нг выделенной ДНК. На реакционную смесь наслаивают 20 мкл минерального масла. Были выбраны следующие условия амплификации: денатурация 94°С/2 мин; 5 циклов: денатурация 94°С/20 с, отжиг 65°С/10 с, элонгация 72°С/10 с; 35 циклов: денатурация – 94°С/5 с, отжиг 65°С/5 с, элонгация 72°С/5 с; 1 цикл: элонгация 72°С/2 мин. Продукты реакции (10 мкл из реакционной смеси) разделяют электрофорезом в 2%-ном агарозном геле с бромистым этидием в ТВЕ – буфере. Для определения длины фрагментов использовали маркер М3 (123 bp DNA Ladder) “GIBCO BRL”. Для проверки чистоты реактивов в качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь вместо исследуемой ДНК добавляли 5 мкл воды.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут.

Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут.

Пример 4. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 5. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 6. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 7. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 8. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 9. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 10. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 11. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 12. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 13. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм.

Пример 14. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут.

Пример 15. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут.

Пример 16. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 17. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 18. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 19. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 20. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 21. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 22. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 23. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 24. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 25. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов.

Пример 26. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов.

Пример 27. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов.

Пример 28. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 29. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 30. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 31. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм.

Пример 32. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут.

Пример 33. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут.

Пример 34. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 35. Проводят аналогично примеру 5, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 36. Проводят аналогично примеру 6, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 37. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 38. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 39. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 40. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 41. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 42. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 43. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм.

Пример 44. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут.

Пример 45. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут.

Пример 46. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 47. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 48. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 49. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 50. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 51. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 52. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 53. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 54. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Результаты, представленные в примерах 1-54, являются стабильно воспроизводимыми и математически усредненными и приведены в Таблице.

Заявленный способ показывает, что использование семян дает возможность получать трансгенные растения в короткие сроки: проростки на наличие трансгена анализируют на 20-й день после начала эксперимента. Заявленный способ предотвращает появление неконтролируемой сомаклональной изменчивости, а также снимает зависимость от морфогенетического потенциала растения.

Кроме того, неожиданным результатом является увеличение выхода трансгенных растений от 3 до 9,6% для пшеницы и до 4% для овсяницы.

Формула изобретения

Способ получения трансгенных однодольных растений, заключающийся в обработке эксплантов вакуумной инфильтрацией в суспензии штамма Agrobacterium tumefaciens GV3850, содержащего селективный ген nptII и целевой ген ipt, причем суспензия Agrobacterium предварительно активизирована экстрактом из листьев табака с последующим инкубированием эксплантов в суспензии Agrobacterium в условиях нормального давления при перемешивании, отличающийся тем, что в качестве эксплантов используют семена, вакуумную инфильтрацию проводят при (-0,7)÷(-0,9) атм в течение 30-50 мин, инкубацию семян в суспензии Agrobacterium – в течение 23-25 ч, выращивание проростков на твердой питательной среде – в течение 3-5 сут без антибиотиков с последующим совместным добавлением канамицина и цефотаксима в концентрациях соответственно 50 мг/л и 300 мг/л для отбора канамицин-устойчивых растений и элиминации Agrobacterium.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 23.11.2007

Извещение опубликовано: 27.07.2009 БИ: 21/2009