Патент на изобретение №2158136

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ IGM-СОДЕРЖАЩЕГО КОНЦЕНТРАТА ИММУНОГЛОБУЛИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и касается производства лечебных препаратов из плазмы или сыворотки донорской крови, а именно способа получения lgM-содержащего концентрата иммуноглобулина. Способ заключается в том, что осадок II+III, полученный при спиртовом фракционировании плазмы (сыворотки) донорской крови, обрабатывается последовательно аэросилом А-380 и натрием каприловокислым с промежуточными центрифугированиями для удаления балластных белков, подвергается ультрафильтрации для удаления низкомолекулярных примесей и концентрирования. После стерилизующей фильтрации получают целевой продукт, содержащий в среднем 15% IgM от общего иммуноглобулина. Преимущество изобретения состоит в обогащении иммуноглобулина IgM. 1 табл.

Изобретение относится к медицине и касается получения лечебных препаратов из плазмы донорской крови
Сырьем для получения препарата служит плазма доноров, проверенная на отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита B (HB_sAg), антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и к вирусу гепатита C.

Прототипом изобретения является способ получения иммуноглобулина человека, нормального для внутримышечного введения (ФС 42-3198-95).

Известно, что внутримышечный человеческий иммуноглобулин содержит в основном иммуноглобулин класса G, что в значительной степени ограничивает его активность по отношению к грамотрицательным микроорганизмам.

Целью настоящего изобретения является получение IgM-содержащего концентрата иммуноглобулина.

Способ осуществляется следующим образом. Объединенный пул плазмы фракционируют этанолом на холоду до стадии осадка II+III; сырой осадок суспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида в весовом соотношении 1:10 и обрабатывают аэросилом А-380, балластный осадок удаляют центрифугированием при 13000 g; добавляют натрий каприловокислый до конечной концентрации 0,4% при слабокислых значениях pH; проводят выстаивание препарата для формирования осадка нестабильных белков, который удаляют центрифугированием; осуществляют ультрафильтрацию для удаления низкомолекулярных примесей и концентрирования и после стерилизующей фильтрации получают целевой продукт.

Пример. Иммунную плазму в количестве 360 л получили методом плазмафереза. Провели спиртовое фракционирование при низких температурах. Было получено 21000 г сырого осадка фракции II+III. Для приготовления IgM-содержащего концентрата иммуноглобулина 260 г осадка суспендировали при постоянном перемешивании в 2600 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Получили 2900 мл исходной суспензии. Добавили 88 г активированного прогреванием при 180^oC в течение 18 часов аэросила А-380. Через 1 час аэросил и балластные белки удалили центрифугированием при 13000 g. Объем центрифугата составил 2170 мл. 0,06 М ацетатным буфером довели pH центрифугата до 4,0, добавили каприлата натрия до конечной концентрации 0,4%. После выстаивания при температуре (203)^oC в течение 18 часов провели центрифугирование при 13000 g. Затем провели диафильтрацию центрифугата 5-кратным объемом раствора натрия хлорида 0,9%, ультрафильтрацию до концентрации белка 5,3%, добавили глюкозу до концентрации (1,00,2)%, гликоля до концентрации (0,50,2)%. Провели стерилизующую фильтрацию раствора. Получили 200 мл готового концентрата. Концентрат иммуноглобулина разливали во флаконы емкостью 50 мл по 25 мл целевого продукта.

В лаборатории препаратов крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови по разработанной технологии изготовлено 7 серий концентрата. В таблице суммированы результаты оценки физико-химических и иммунобиологических свойств полученных серий. Концентрат представил собой прозрачный бесцветный или слегка опалесцирующий раствор, прозрачность составила в среднем (0,0130,001), цветность – (0,046 0,002) ед. оптич. плотности. В течение срока наблюдения (до 12 мес.) образования осадка или мелкодисперсной взвеси в растворах не отмечено. pH колебалась от 4,63 до 5,21. Концентрация белка составила в среднем (5,67 0,07)%.

По сравнению с прототипом концентрат обладает низкой антикомплементарной активностью (АКА): в экспериментальных образцах она составляла от 3,2 до 6,54 мг белка, не активирующих 2 CH₅₀ комплемента. (Уровень АКА внутримышечных иммуноглобулина отличается от этого показателя на 3 порядка и составляет приблизительно 1,510^-3 мг).

Оценка фракционного состава полученных образцов методом иммуноэлектрофореза выявила наличие 4 дуг преципитации, соответствующих IgG, IgA, IgM и небольшому количеству альбумина. Процентное соотношение IgG:IgA:IgM оказалось равным в среднем 66,6:18,1:15,3%.

Молекулярные параметры образцов оценивались методом гельпроникающей хроматографии низкого давления с АСА-34. Элюирование проводили 0,05 М фосфатным буфером. На хроматограмме выделялись 3 пика, соответствующие фракциям с молекулярными массами более 160 тыс. Д (IgM), 150-160 тыс. Д (суммарный пик IgG и IgA), третий – 50-70 тыс. Д. Последний говорит о наличие альбумина. Отсутствие в образцах полимеров IgG было подтверждено отсутствием во фракции более 160 тыс. Д иммуноглобулина G, доказанное методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. Процентное соотношение фракций было следующим: содержание IgM колебалось от 9 до 18%, IgG+IgA – от 70 до 80%, альбумина – от 5 до 9%.

По данным биологического теста IgM-содержащий концентрат нетоксичен, апирогенен.

По данным РПГА концентрат обладает высокой активностью антител к синегнойной палочке: средняя геометрическая обратного титра составила 146,9. По данным ИФА наличие IgG-антител к липополисахаридам синегнойной палочки колебалось от 3,28 до 16,58 ЕД_ИФА/мг белка, IgM-антител – от 0,18 до 1,80 ЕД_ИФА/мг белка. Соответствующие показатели для E.coli составили в среднем 8,31 0,85 и 1,12 0,25. ЕД_ИФА/мг белка. Необходимо подчеркнуть, что в препарате иммуноглобулина, получаемом методом-прототипом, обратный титр антисинегнойных антител в РПГА колеблется около 80, в ИФА активность IgG к ЛПС синегнойной палочки в среднем равняется 1,60 0,27, IgM – 0,01 0,01; к E.coli – 10,46 0,87, IgM – 0,03 0,01 ЕД_ИФА/мг белка.

Таким образом, получен концентрат иммунологически активной фракции донорской крови, содержащий в среднем 15% IgM от общего иммуноглобулина и обладающий высокой активностью антител по отношению к грамотрицательным возбудителям и низкой антикомплементарной активностью.

Предложенный способ получения IgM-содержащего концентрата иммуноглобулина из осадка фракции II+III может использоваться при создании производственной технологии изготовления IgM-содержащего препарата иммуноглобулина.

Формула изобретения

Способ получения IgM-содержащего концентрата иммуноглобулина, заключающийся в том, что проводят спиртовое фракционирование плазмы при низких температурах, получают сырой осадок фракции II + III, отличающийся тем, что его суспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида в весовом соотношении 1 : 10 и обрабатывают аэросилом А-380, балластный осадок удаляют центрифугированием при 13000g, добавляют натрий каприловокислый до конечной концентрации 0,4% при слабокислых значениях pH, проводят выстаивание концентрата для формирования осадка нестабильных белков, который удаляют центрифугированием, осуществляют ультрафильтрацию для удаления низкомолекулярных примесей и концентрирования препарата и после стерилизующей фильтрации получают целевой продукт.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 16.06.2005

Извещение опубликовано: 10.06.2006 БИ: 16/2006