Патент на изобретение №2158134

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ ПАРОТИТНО-КОРЕВОЙ ВАКЦИНЫ

(57) Реферат:

Назначение: производство вакцины. Трипсинизированные первичные культуры клеток эмбрионов перепелов заражают раздельно штаммами вирусов эпидемического паротита (Л-3) и кори (Л-16). Затем проводят инкубирование в ростовой среде в присутствии антибиотика и ростовых протеинов. Отмывают клетки поддерживающей средой не менее 6 раз для каждого компонента. После этого проводят дальнейшее инкубирование и сбор вируссодержащей жидкости. В нее добавляют стабилизатор. Приготовленные жидкие монокомпоненты замораживают и хранят до окончания контролей. Перед расфасовкой монокомпоненты смешивают с соблюдением определенных пропорций для получения ассоциированной вакцины с заданными концентрациями компонентов эпидемического паротита и кори. Изобретение позволит увеличить урожайность вирусов, повысить стандартность вирусного материала по специфической активности, а также уменьшить поствакцинальные осложнения и аллергические проявления. 12 з.п.ф-лы.

Способ относится к области биотехнологии, а именно к производству вакцин.

Известен способ получения ассоциированной паротитно-коревой вакцины, включающий заражение штаммами вирусов эпидемического паротита и кори первичной культуры клеток эмбрионов перепелов с инкубированием в ростовой среде, содержащей ростовые протеины, последующую отмывку клеток, дальнейшее инкубирование и сбор вируссодержащей жидкости (см. авт. свид. СССР 701147, A 61 K 39/165, 13.06.77).

Недостатками этого способа являются непрогнозируемый разброс значений прививочных доз эпидемического паротита и кори в препарате, невозможность получения препарата с заданными концентрациями, высокое содержание белка, невозможность получения моновакцин.

Устранение указанных недостатков достигается тем, что вирусы эпидемического паротита и кори инкубируют в роллерных установках раздельно в присутствии антибиотика, собранную вируссодержащую жидкость подвергают осветляющей фильтрации, затем добавляют стабилизатор и объединяют в пропорциях, соответствующих конечным прививочным дозам паротитного компонента – не ниже 20 000 ТЦД 50/0,5 мл, коревого – не ниже 1 000 ТЦД 50/0,5 мл.

Сущность способа заключается в следующем.

Трипсинизированные первичные культуры клеток эмбрионов перепелов заражают штаммами вирусов эпидемического паротита и кори. В качестве вакцинного штамма вируса эпидемического паротита используют штамм Ленинград – 3 (Л-3), в качестве вакцинного штамма вируса кори используют штамм Ленинград – 16 (Л-16). Множественность заражения для штамма вируса эпидемического паротита составляет 0,00001 – 0,001 ТЦД/50 на клетку, для штамма вируса кори 0,001 – 0,01 ТЦД /50 на клетку соответственно. Затем проводят инкубирование в ростовой среде в присутствии антибиотика и ростовых протеинов при температуре от +34 до +36^oC в течение 2 – 3 сут для эпидемического паротита и в течение 4 – 6 сут для кори. Затем из роллерных бутылей удаляют ростовую среду и осуществляют отмывку клеток поддерживающей средой не менее 6 раз как для паротитного, так и для коревого компонентов, что позволяет получить ассоциированную вакцину с количеством белка (протеинов) не более 8 мкг/дозу. После этого проводят дальнейшее инкубирование и сбор вируссодержащей жидкости, которую подвергают осветляющей фильтрации, затем добавляют стабилизатор. В качестве стабилизаторов используют ЛС-18 с желатином или сорбит с желатозой. А также в качестве одного из стабилизаторов вместо желатина или желатозы может быть использован полиглюкин или поли-N-винилпирролидон, который применяют с молекулярной массой не менее 12 кД с целью стандартизации препаратов. Приготовленные жидкие монокомпонентные препараты замораживают и хранят до окончания контролей.

Компоненты эпидемического паротита и кори объединяют в пропорциях, соответствующих конечным прививочным дозам паротитного компонента – не ниже 20 000 ТЦД 50/0,5 мл, а коревого – не ниже 1 000 ТЦД 50/0,5 мл.

Ассоциированную вакцину можно получать с заданными концентрациями компонентов, которые определяют по формуле:
Q=T₂/T₁N,
где Q – объем каждого исходного компонента, в литрах;
T₁ – исходная активность компонента, в ТЦД 50/0,5 мл;
Т₂ – заданная активность компонента в ассоциированной вакцине, в ТЦД 50/0,5 мл;
N – заданный объем ассоциированного препарата, в литрах.

Жидкую паротитно-коревую вакцину разливают в ампулы или флаконы с последующим замораживанием и лиофилизацией.

Заморозку препарата осуществляют от -30 до -55^oC в течение 3 – 6 ч. Затем вакцину лиофилизируют при температуре от -17 до – 28^oC в течение 24 – 60 ч с последующим нагревом до температуры от +22 до +28^oC в течение 8-14 ч.

Пример 1
Свежеприготовленную суспензию первичной культуры клеток эмбрионов перепелов в среде 199 разливают в одноразовые роллерные бутыли по 200 тыс. клеток на 1 см² поверхности и заражают вирусом эпидемического паротита (штамм Л-3) с множественностью заражения 0,00001 ТЦД/50 на клетку во взвесь. Аналогичную операцию проводят для вируса кори (штамм Л-16) с множественностью заражения 0,008 ТЦД/50 на клетку во взвесь. Культуры инкубируют в ростовой среде, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота или телячью, или эмбриональную сыворотку, а также антибиотик – гентамицина сульфат в концентрации 100 ед/мл и инкубируют при температуре +35,2^oC для эпидемического паротита в течение 72 ч, для кори – в течение 96 ч. После этого проводится шестикратное отмывание как для одного, так и для другого компонента. На 4-е сутки от момента заражения начинается сбор вируссодержащей жидкости для эпидемического паротита, а на 8-е сутки для кори. После получения результатов контроля на стерильность и специфическую активность индивидуальные вирусные сборы каждого компонента объединяются отдельно друг от друга и подвергаются осветляющей фильтрации. Проводится контроль на остаточный белок, отсутствие интактных клеток и стерильность. Затем добавляется стабилизатор и еще раз проводится контроль на специфическую активность и стерильность. Монопрепараты объединяются непосредственно перед лиофилизацией в соответствующих пропорциях для получения ассоциированной вакцины.

Пример 2
Свежеприготовленную суспензию первичной культуры клеток эмбрионов перепелов в среде 199 разливают в одноразовые роллерные бутыли по 200 тыс. клеток на 1 см² поверхности и заражают вирусом эпидемического паротита (штамм Л-3) с множественностью заражения 0,00009 ТЦД/50 на клетку во взвесь. Аналогичную операцию проводят для вируса кори (штамм Л-16) с множественностью заражения 0,0095 ТЦД/50 на клетку во взвесь. Культуры инкубируют в ростовой среде, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота или телячью, или эмбриональную сыворотку, а также антибиотик – гентамицина сульфат в концентрации 100 ед/мл – и инкубируют при температуре +34,5^oC для эпидемического паротита в течение 60 ч, для кори – в течение 96 ч. После этого проводится шестикратное отмывание как для одного, так и для другого компонента. На 3-и сутки от момента заражения начинается сбор вируссодержащей жидкости для эпидемического паротита, и на 8-е сутки для кори. После получения результатов контроля на стерильность и специфическую активность индивидуальные вирусные сборы каждого компонента объединяются отдельно друг от друга и подвергаются осветляющей фильтрации. Проводится контроль на остаточный белок, отсутствие интактных клеток и стерильность. Затем добавляется стабилизатор и еще раз проводится контроль на специфическую активность и стерильность. Монопрепараты объединяются непосредственно перед лиофилизацией в соответствующих пропорциях для получения ассоциированной вакцины.

Пример 3
Для получения ассоциированной паротитно-коревой вакцины в объеме 7 л (N – здесь и далее обозначение параметра согласно формуле, приведенной на стр. 2) с конечной активностью паротитного компонента (Т_2п) – 100 000 ТЦД 50/0,5 мл и коревого компонента (Т_2к) – 10 000 ТЦД5 0/0,5 мл рассчитывают объемы каждого компонента по формуле, приведенной на стр. 2, исходя из известной активности монопрепаратов.

Исходная активность паротитного компонента (Т_1п) – 141300 ТЦД 50/0,5 мл.

Исходная активность коревого компонента (Т_1к) – 35480 ТЦД 50/0,5 мл.

Подставляя в формулу известные значения, получаем необходимые для сведения объемы монопрепаратов:
Q_п = (100 000/141300)7 = 4.95 л (~5,0 л);
Q_к = (10 000/35480)7 = 1,97 л (~2,0 л),
а именно паротитного компонента необходимо 5 л, а коревого 2 л.

Пример 4
Разлитый в ампулы жидкий полуфабрикат паротитно-коревой вакцины со стабилизатором ЛС-18 замораживают на полке при температуре ниже – 35^oC в течение 3 ч, вакуумируют при той же температуре. Затем полки нагревают до -20^oC. Сублимация проводится при температуре от -20 до -22 ^oC в течение 45 ч. После этого полки нагревают до +25 ^oC в течение 10 ч. Досушивание проводят при температуре полки от +25 до +28 ^oC в течение 8 ч.

Пример 5
Разлитый в ампулы жидкий полуфабрикат паротитно-коревой вакцины со стабилизатором – сорбит с желатозой замораживают на полке при температуре ниже -30^oC в течение 4 ч, вакуумируют при той же температуре. Затем полки нагревают до -27^oC. Сублимация проводится при температуре от -25 до -28^oC в течение 52 ч. После этого полки нагревают до +25^oC в течение 8 ч. Досушивание проводят при температуре полки от +25 до +28^oC в течение 11 ч.

Настоящий способ позволяет увеличить урожайность вирусов эпидемического паротита и кори с единицы площади поверхности. Объединение индивидуальных вирусных сборов с последующей осветляющей фильтрацией стандартизирует вирусный материал по специфической активности и остаточному белку при гарантированном отсутствии интактных клеток субстрата. Неиспользованные в ассоциации материалы могут быть использованы для получения монопрепаратов. Способ также позволяет уменьшить поствакцинальные осложнения, такие как аллергические проявления и реактогенность за счет снижения содержания белка в препарате.

Формула изобретения

1. Способ получения ассоциированной паротитно-коревой вакцины, включающий заражение штаммами вирусов эпидемического паротита и кори первичной культуры клеток эмбрионов перепелов с инкубированием в ростовой среде, содержащей ростовые протеины, последующую отмывку клеток, дальнейшее инкубирование и сбор вируссодержащей жидкости, отличающийся тем, что вирусы эпидемического паротита и кори инкубируют в роллерных установках в присутствии антибиотика раздельно, собранную вируссодержащую жидкость подвергают осветляющей фильтрации, затем добавляют стабилизатор и объединяют в пропорциях, соответствующих конечным прививочным дозам паротитного компонента – не ниже 20 000 ТЦД 50/0,5 мл, коревого – не ниже 1000 ТЦД 50/0,5 мл, затем препарат лиофилизируют.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве вакцинных штаммов используют для вируса эпидемического паротита – штамм Л-3, для вируса кори – штамм Л-16.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что множественность заражения для штамма вируса эпидемического паротита составляет 0,00001 – 0,001 ТЦД/50 на клетку, для штамма вируса кори – 0,001 – 0,01 ТЦД/50 на клетку.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубирование проводят при температуре от +34 до +36^oC.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубирование проводят в роллерных установках.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что отмывку клеток поддерживающей средой осуществляют не менее 6 раз как для паротитного, так и для коревого компонентов.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизаторов используют ЛС-18 с желатином или сорбит с желатозой.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что в качестве одного из стабилизаторов вместо желатина или желатозы используют полиглюкин или поли-N-винилпирролидон.

9. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что поли-N-винилпирролидон используют с молекулярной массой не менее 12 кД.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество протеина в ассоциированной вакцине не превышает 8 мкг/дозу.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед лиофилизацией препарат замораживают в пределах Т = -30 – -55^oC в течение 3 – 6 ч.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что лиофилизацию проводят при температуре от -17 до -28^oC в течение 24 – 60 ч с последующим нагревом до температуры +22 – +28^oC в течение 8 – 14 ч.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что ассоциированную вакцину получают с заданными концентрациями компонентов, которые определяют по формуле
Q = Т₂/Т₁ N,
где Q – объем каждого исходного компонента, л;
Т₁ – исходная активность компонента, ТЦД 50/0,5 мл;
Т₂ – заданная активность компонента в ассоциированном препарате, ТЦД 50/0,5 мл;
N – заданный объем ассоциированного препарата, л.

PD4A – Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 21-2004

(73) Новое наименование патентообладателя:

Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген”

(73) Новое наименование патентообладателя:

Зайцев Игорь Закванович

(73) Новое наименование патентообладателя:

Колышкин Владимир Михайлович

(73) Новое наименование патентообладателя:

Сидоренко Елена Серафимовна

(73) Новое наименование патентообладателя:

Попов Владимир Федорович

(73) Новое наименование патентообладателя:

Юминова Надежда Васильевна

(73) Новое наименование патентообладателя:

Красильников Игорь Викторович

(73) Новое наименование патентообладателя:

Дорофеева Людмила Васильевна

Извещение опубликовано: 27.07.2004