Патент на изобретение №2300571
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для ранней диагностики туберкулеза. Питательная среда для выделения микобактерий содержит калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железо лимоннокислое аммиачное, аминокислоту, агар-агар, глицерин, сыворотку лошадиную инактивированную, краситель малахитовый зеленый и воду дистиллированную. Введение
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для ранней диагностики туберкулеза. В последнее время наблюдается рост показателей заболеваемости туберкулезом. В этой связи значительное внимание уделяется лабораторной диагностике туберкулеза. В настоящее время для выделения (культивирования) микобактерий и определения их чувствительности к лекарственным препаратам используется ряд плотных яичных питательных сред Левенштейна-Иенсена, Финн II [Приказ МЗ РФ от 21.03. 2003 №109 “О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации” М., стр.266-270], среда Мордовского [Методические указания МЗ РСФСР “Приготовление и использование новой питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза”, М. – 1972]. Недостатком плотных питательных сред являются длительные сроки роста микобактерий при посеве диагностического материала – 2,5-10 недель, а при пересевах культур и определении лекарственной чувствительности – 12-21 день, что затрудняет раннюю бактериологическую диагностику и своевременную коррекцию лечения. Применение жидких питательных сред позволяет ускорить выявление микобактерий, что важно для раннего начала лечения больных туберкулезом. Известно использование для этих целей жидких сред, содержащих комплекс солей и L-аспарагин в качестве источника азотистого питания: Соттона (Sauton) [B.H.Василев. Микобактериозы и микозы легких. София, 1971 г., стр.156], Школьниковой [Приказ МЗ РФ от 21.03. 2003 №109 “О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации”. М., стр.270-271]. Недостатком этих сред является высокая степень проростов посторонней микрофлоры и использование дорогостоящих ингредиентов. Наиболее близким решением технической задачи данного назначения к заявляемому изобретению является среда для выделения микобактерий туберкулеза Lebek [B.H.Василев. Микобактериозы и микозы легких. София, 1971 г., стр.163], содержащая аспарагин, натрий лимоннокислый, магний сернокислый, железо лимоннокислое аммиачное, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, глицерин, дистиллированную воду, краситель бромтимоловый синий, агар-агар и говяжью сыворотку крови. Однако эта среда используется в основном для дифференцировки атипичных микобактерий. Входящий в состав питательной среды бромтимоловый синий оказывает тормозящее действие на рост микобактерий туберкулеза, а под влиянием аспарагина возникает конгломеративный рост колоний микобактерий, что осложняет учет результатов исследований. В основу изобретения поставлена задача повышения ростовых свойств питательной среды. Поставленная задача решается тем, что в среду, содержащую калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железо лимоннокислое аммиачное, фактор роста, агар-агар, глицерин, сыворотку животного, бактерицидный краситель и воду, дополнительно вводят в качестве ростового фактора натрий пировинограднокислый, в качестве аминокислоты используют Состав питательной среды при следующих соотношениях, г/л:
Среду получают следующим образом. Пример 1. 1. В 20 мл горячего глицерина растворяют 0,04 г малахитового зеленого. 2. 150 мл лошадиной сыворотки инактивируют при 56°С 40 мин и соединяют с раствором малахитового зеленого. 3. Готовят солевой раствор, для чего в 200 мл дистиллированной воды последовательно растворяют 2,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 1,0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,25 г магния сернокислого, 1,0 г натрия лимоннокислого, 0,03 г железа лимоннокислого аммиачного, 0,5 г Полученный раствор стерилизуют в автоклаве при 1,5 атм 1 мин и после охлаждения соединяют со смесью 2. 4,2 г агар-агара растворяют в оставшемся количестве дистиллированной воды, стерилизуют при 1 атм 30 мин, соединяют со смесью 3, тщательно перемешивают. Контроль качества среды осуществляют при посеве тест-штаммов Mycobacterium tuberculosis H37Rv, B-5 и свежевыделенных культур от больных туберкулезом легких. Учет результатов проводят визуально по помутнению среды через 2-8 суток инкубации посевов при температуре 37°С.После 2-8 суток инкубации содержимое пробирок центрифугируют при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, из осадка делают мазки для просмотра в люминесцентном микроскопе. Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что для приготовления смеси 1 используют 30 мл глицерина и 0,05 г малахитового зеленого, для приготовления смеси 2 – 200 мл лошадиной сыворотки, для солевого раствора – 2,5 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 1,5 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,5 г магния сернокислого, 1,5 г натрия лимоннокислого, 0,05 г железа лимоннокислого аммиачного, 1,0 г Пример 3. Отличается от примера 1,2 тем, что для приготовления смеси 1 используют 40 мл глицерина и 0,06 г малахитового зеленого, для приготовления смеси 2 – 250 мл лошадиной сыворотки, для солевого раствора – 3,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 2,0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,75 г магния сернокислого, 2,0 г натрия лимоннокислого, 0,07 г железа лимоннокислого аммиачного, 1,5 г После 2-8 суток инкубации содержимое пробирок центрифугируют при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, из осадка делают мазки для просмотра в люминесцентном микроскопе. Результаты бактериологического контроля предлагаемой и известной сред представлены в таблице. Из таблицы видно, что сроки роста микобактерий туберкулеза на предлагаемой питательной среде сократились по сравнению с прототипом у лабораторного штамма H37Rv в 1,3-1,6 раза, у штаммов, выделенных от больных, в 1,3-1,7 раза и составили в среднем 6 суток. Выявляемость микобактерий туберкулеза из мокроты больных увеличилась при отрицательных результатах бактериоскопии с 27 до 33%, при положительной бактериоскопии с 66 до 78%, при сокращении сроков роста по сравнению с прототипом на 205 суток. Таким образом, предлагаемая среда обеспечивает рост микобактерий туберкулеза, что способствует их выявляемости в максимально короткие сроки.
Формула изобретения
Питательная среда для выделения микобактерий, содержащая калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железо лимоннокислое аммиачное, аминокислоту, агар-агар, глицерин, сыворотку животного, бактерицидный краситель и воду дистиллированную, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит натрий пировинограднокислый, в качестве аминокислоты –
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
-аминоуксусной кислоты и натрия пировинограднокислого способствует ускорению роста микобактерий с гомогенным их распределением в питательной среде. Инактивация лошадиной сыворотки при 56°С в течение 40 минут снижает ее ингибирующее действие на микобактерии. Бактерицидный краситель – малахитовый зеленый обладает оптимальным действием на сопутствующую микрофлору, не вызывая задержки роста микобактерий. Изобретение обеспечивает повышение ростовых свойств питательной среды, ускоряет рост микобактерий, что способствует их выявляемости в максимально короткие сроки. 1 табл.