Патент на изобретение №2300384

(54) ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ И РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к фармации и биотехнологии, и может быть использовано для получения лекарственных средств с противовоспалительным, иммуномодулирующим и ранозаживляющим свойствами и касается нового биологически активного вещества, содержащего комплекс гуморальных факторов аллогенных диплоидных фибробластов (АДФ), и полученное механической дезагрегацией донорской ткани, добавлением питательной среды, культивированием во влажной атмосфере с 5% CO₂ и отделением супернатанта. Изобретение обеспечивает уменьшение ограничения в применении и удешевление в получении. 2 табл., 10 ил. мононуклеарами периферической крови здоровых доноров;

– на фиг.6 – влияние супернатантов АДФ на ЛПС-стимулированную продукцию ФНО- мононуклеарами периферической крови здоровых доноров;

– на фиг.7 – влияние супернатантов АДФ на спонтанную продукцию ИЛ-1 мононуклеарами периферической крови здоровых доноров;

– на фиг.8 – влияние супернатантов АДФ на ЛПС-стимулированную продукцию ИЛ-1 мононуклеарами периферической крови здоровых доноров;

– на фиг.9 – влияние супернатантов АДФ на спонтанную продукцию раИЛ-1 мононуклеарами периферической крови здоровых доноров;

– на фиг.10 – влияние супернатантов АДФ на ЛПС-стимулированную продукцию раИЛ-1 мононуклеарами периферической крови здоровых доноров.

На всех фигурах и во всех таблицах: *¹ – р<0,05 по сравнению с контролем. Для статобработки использовали дисперсионный анализ и критерий Ньюмена-Кейлса.

Способ осуществляется следующим образом.

Перевиваемые линии АДФ получали оригинальным бесферментативным методом, отличающимся от общепринятого отказом от использования протеолитических ферментов (трипсин, коллагеназа, террилитин и др.). Кусочки тканей (абортный материал, кусочки дермы, костный мозг, легких) подвергали механической дезагрегации до фрагментов размером 0,1-0,2 мм³, добавляли питательную среду 199, дополненную 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, – для эмбриональных и фетальных тканей, или питательную среду RPMI 1640, дополненную 20% сыворотки эмбрионов коров, – для постнатального материала. Фрагменты тканей ресуспендировали в указанной среде, вносили в культуральные пластиковые флаконы и культивировали во влажной атмосфере с 5% СО₂. В течение 1-3 суток происходила миграция фибробластов из тканевых фрагментов и прикрепление к дну культуральных флаконов. После этого фрагменты тканей со средой из флаконов удаляли, а к прикрепленным клетками добавляли свежую среду, соответствующую степени зрелости их источника. После формирования на дне культуральных флаконов монослоя АДФ отработанную питательную среду удаляли, к клеткам добавляли бессывороточную среду 199 и вновь культивировали в течение 24 ч в стандартных условиях. Через сутки кондиционированную АДФ среду сливали и проверяли в последующих экспериментах на биологическую активность, а клеточный монослой пересевали на новые флаконы со сменой среды и контролем бактериологической чистоты и кариотипа клеток.

Предлагаемый способ бесферментативного получения культур клеток позволяет обеспечить минимальное повреждение клеток и снизить экономические затраты на начальном этапе.

Биологическая активность вещества иллюстрирована в нижеприведенных экспериментах.

Пример 1. Влияние супернатантов АДФ на функциональную активность Нф периферической крови здоровых доноров in vitro.

В качестве супернатантов использовали кондиционированную в течение 24 ч эмбриональными (СЭФ) или зрелыми легочными (СЗФЛ) фибробластами среду 199. МНК и нейтрофилы (Нф) получали из венозной крови здоровых добровольцев общепринятым методом выделения на двойном градиенте плотности фиколл-гипак 1,077 и 1,114. После отмывки Нф ресуспендировали в бессывороточной среде 199 и вносили в лунки 96-луночного планшета в конечной концентрации 2×10⁵/лунку. К МНК добавляли суточный СЭФ и СЗФЛ в конечной концентрации 25%, в контрольные лунки добавляли аналогичный объем бессывороточной среды 199. Клетки инкубировали в течение 2 ч в термостате при +37°С, по окончании инкубации трижды отмывали от неприкрепившихся клеток подогретым до +37°С фосфатно-солевым буфером. Дальнейшие эксперименты проводили по методикам, описанным Р.М.Хаитовым и соавт. (Экологическая иммунология / Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин, Х.И.Истамов. – М.: ВНИРО, 1995. – 219 с.).

Показатели активности нейтрофилов представлены в табл. 1 и на фиг.1-4.

Пример 2. Влияние супернатантов АДФ на продукцию ФНО- и ИЛ-1 мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови здоровых доноров in vitro.

После отмывки МНК ресуспендировали в полной питательной среде RPMI-1640 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки и вносили в лунки 24-луночного планшета в конечной концентрации 1×10⁶/лунку. К МНК добавляли суточный СЭФ и СЗФЛ в конечной концентрации 25%, в контрольные лунки добавляли аналогичный объем бессывороточной среды 199. В часть лунок вносили ЛПС в концентрации 10 мкг/лунку. Клетки инкубировали в течение суток в СО₂-инкубаторе и по окончании инкубации оценивали концентрацию ФНО и ИЛ-1 в твердофазном ИФА с использованием тест-систем фирмы «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург, Россия). Полученные результаты представлены в табл.1 и на фиг.1-4. Как видно из фиг.5 и 6 и табл.2, СЭФ и СЗФЛ статистически значимо стимулируют спонтанную продукцию ФНО-, однако данный эффект не имеет клинического значения, поскольку концентрации ФНО- сопоставимы с нормальным содержанием данного цитокина в сыворотке крови здорового человека. Аналогичный, статистически значимый эффект СЭФ и СЗФЛ оказывают и на спонтанную продукцию ИЛ-1 (табл.2 и фиг.7 и 8). При стимуляции МНК с помощью ЛПС отмечено значительное статистически значимое ингибирующее влияние обоих супернатантов на продукции провоспалительных цитокинов ФНО- и ИЛ-1.

Пример 3. Влияние супернатантов АДФ на продукцию рецепторного антагониста ИЛ-1 (раИЛ-1) МНК периферической крови здоровых доноров in vitro.

Общая схема опытов идентична описанной для исследования продукции ФНО- и ИЛ-1, за исключением тест-систем для определения концентрации раИЛ-1 («Цитокин», Санкт-Петербург, Россия). Полученные результаты представлены в табл. 2 и на фиг.9 и 10. Видно, что супернатанты АДФ статистически значимо усиливали как спонтанную, так и ЛПС-стимулированную продукцию МНК доноров этого важного противовоспалительного цитокина.

Таким образом, супернатанты АДФ in vitro оказывали противовоспалительное влияние, выражавшееся в подавлении продукции провоспалительных цитокинов аллогенными мононуклеарными клетками в условиях стимуляции липополисахаридом, подавление адгезионной способности аллогенных нейтрофилов. При этом отмечается стимуляция продукции раИЛ-1 мононуклеарами, особенно в условиях индукции липополисахаридом, и повышение активности факторов бактерицидности нейтрофилов.

Пример 4. Влияние супернатантов АДФ на сроки эпителизации экспериментальной ожоговой раны (ЭОР) у крыс.

Под эфирным наркозом 10 крысам линии Вистар раскаленным до 200°С электродом площадью 1 см² путем контактного воздействия в течение 2 с наносили 3 экспериментальных ожоговых раны (ЭОР) на область спины. На каждую из ран накладывали стерильную салфетку, пропитанную раствором 0,05% фурацилина (контроль), СЭФ или СЗФЛ, которые фиксировали лейкопластырем. На шею крысы фиксировали пластиковый воротник и каждую крысу помещали в отдельную клетку для исключения самостоятельного и взаимного повреждения наклеек. Под эфирным наркозом ежедневно в течение 21 дня производили перевязку со сменой салфеток с супернатантами АДФ и раствором антисептика. При формировании струпа на ране во время перевязки его тангенциально иссекали. За указанный период отмечена полная эпителизация ЭОР, леченных СЭФ, – у 8 крыс, леченных СЗФЛ – у 7 крыс, леченных раствором фурацилина – у 2 крыс.

Таб.1.

Показатели (пкг/мл)

Адгезия (n=32)

Миелопероксидаза (n=26)

НСТ-тест (n=26)

Кислая фосфатаза (n=26)

спонтанная

зимозан-стим.

спонтанная

зимозан-стим.

спонтанная

зимозанстим.

Контроль

93,8±1,1

95,5±1,1

93,0±1,8

91,9±1,8

95,1±1,3

96,6±0,9

95,7±1,3

СЭФ

66,6±4,7*1

111,6±9,2

86,9±9,0

190,1±20,7*1

101,7±5,6

119,0±9,6

109,4±6,2

СЗФЛ

73,8±5,4*1

114,7±10,7

82,1±5,6

178,6±19,9*1

102,6±5,1

100,0±6,9

104,6±6,3

Таб. 2.

Показатели (пкг/мл)

ФНО- (n=32)

ИЛ-1 (n=32)

раИЛ-1 (n=32)

спонтанная

ЛПС-стим.

спонтанная

ЛПС-стим.

спонтанная

ЛПС-стим.

Контроль

19,3±12,8

1051,9±175,8

9,5±9,2

2614,6±551,1

102,5±68,2

1225,9±358,9

СЭФ

29,9±8,8

523,8±113,9*1

49,9±30,0*1

1567,9±321,7*1

322,7±106,4*1

2174,0±319,4*1

СЗФЛ

23,1±8,1

548,6±92,9*1

50,8±24,2*1

1729,7±391,6*1

284,6±127,4*1

1970,9±404,5*1

Формула изобретения

Вещество, обладающее противовоспалительной, иммуномодулирующей и ранозаживляющей активностью, характеризующееся тем, что содержит супернатант культуры аллогенных диплоидных фибробластов (АДФ), включающий комплекс гуморальных факторов, продуцируемых АДФ, и полученное механической дезагрегацией донорской ткани, добавлением питательной среды, культивированием во влажной атмосфере с 5% CO₂ и отделением супернатанта.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 01.02.2007

Извещение опубликовано: 10.04.2009 БИ: 10/2009