Патент на изобретение №2300380

(54) ПРОИЗВОДНЫЕ ТЕТРАЦИКЛИНА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и касается вариантов способа лечения рака, включающего введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества 9-амино-6-дезокси-5-гидрокситетрациклина или его соли, либо 9-нитро-6-дезокси-5-гидрокситетрациклина или его соли. При этом рак выбран из группы, включающей рак молочной железы, меланому, миелому и рак простаты. Изобретение обеспечивает противоопухолевый, антиметастатический эффект и увеличение коэффициента выживаемости за счет установленного ингибирования указанными производными тетрациклина матриксразрушающих металлопротеиназ, причем без значительной потери веса тела. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 табл.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение касается новых производных тетрациклина, способов получения новых производных и способов применения этих производных.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Соединение тетрациклин имеет следующую общую структуру:

Система нумерации циклических ядер представляет собой следующее:

Тетрациклин, а также его производные 5-ОН (террамицин) и 7-Cl (ауреомицин) существуют в природе и являются хорошо известными антибиотиками. Природный тетрациклин может быть модифицирован без потери его антибиотических свойств, хотя определенные элементы структуры должны сохраняться. Модификации, которые могут и не могут быть сделаны в основной тетрациклиновой структуре, были представлены в обзоре Mitscher в The Chemistry of Tetracyclines, Chapter 6, Marcel Dekker, Publishers, New York (1978). Согласно Mitscher, заместители в положениях 5-9 тетрациклиновой кольцевой системы могут быть модифицированы без полной потери антибиотических свойств. Однако изменения в основной кольцевой системе или замена заместителей в положениях 1-4 и 10-12 обычно приводят к образованию синтетических тетрациклинов со значительно меньшей антимикробной активностью или фактически неактивных. Некоторые примеры химически модифицированных неантимикробных тетрациклинов (в дальнейшем ХМТ) представляют собой 4-дедиметиламино-тетрациклин, 4-дедиметиламиносанциклин(6-деметил-6-дезокси-4-дедиметиламинотетрациклин), 4-дедиметиламиноминоциклин(7-диметиламино-4-дедиметиламинотетрациклин) и 4-дедиметиламинодоксициклин(5-гидрокси-6-дезокси-4-дедиметиламинотетрациклин).

Некоторые производные 4-дедиметиламинотетрациклина раскрыты в Патентах US 3029284 и US 5122519. Они включают 6-деметил-6-дезокси-4-дедиметиламинотетрациклин и 5-гидрокси-6-дезокси-4-дедиметиламинотетрациклин с водородом и другими заместителями в С7- и С9-положениях в D-кольце. Эти заместители включают амино, нитро, ди-(низший алкил)амино и моно-(низший алкил)амино или галоген. Авторы упоминают, что производные 6-деметил-6-дезокси-4-дедиметиламинотетрациклина и производные 5-гидрокси-6-дезокси-4-дедиметиламинотетрациклина полезны в качестве антимикробных агентов.

Другие производные 4-дедиметиламинотетрациклина с оксим-группой в С4-положении в А-кольце раскрыты в Патентах US 3622627 и US 3824285. Эти оксим-производные имеют водород и галоген в качестве заместителей в С7-положении и включают 7-галоген-6-деметил-6-дезокси-4-дедиметиламино-4-оксиминотетра-циклин и 7-галоген-5-гидрокси-6-дезокси-4-дедиметиламино-4-оксиминотетрациклин.

Группы алкиламино (МН-алкил) и алкилгидразон (N-NH-алкил) были замещены в А-кольце в С4-положении 4-дедиметиламинотетрациклина. Эти соединения известны своими антимикробными свойствами. См. Патенты US 3345370, US 3609188, US 3622627, US 3502660, US 3509184, US 3502696, US 3515731, US 3265732, US 5122519, US 3849493, US 3772363 и US 3829453.

Было описано, что кроме антимикробных свойств тетрациклины имеют и некоторые другие применения. Например, известно также, что тетрациклины ингибируют активность ферментов, разрушающих коллаген, таких как матриксные металлопротеиназы (ММР), включая коллагеназы (ММР-1), желатиназу (ММР-2) и стромелизин (ММР-3) (Golub et al., J. Periodont. Res. 20:12-23 (1985); Golub et al. Crit. Revs. Oral Biol. Med. 2:297-322 (1991); Патенты US 4666897, US 4704383, US 4935411, US 4935412). Известно также, что тетрациклины ингибируют атрофию и деградацию белков в скелетных мышцах млекопитающих (Патент US 5045538) и увеличивают продукцию IL-10 в клетках млекопитающих.

Кроме того, сообщалось, что тетрациклины увеличивают белковый синтез в костях (Патент US Re. 34656) и уменьшают резорбцию кости в органной культуре (Патент US 4704383).

Аналогично, Golub с соавт. в Патенте US 5532227 раскрывают, что тетрациклины могут воздействовать на избыточное гликозилирование белков. В частности, тетрациклины ингибируют избыточное перекрестное связывание коллагена, которое является результатом избыточного гликозилирования коллагена при диабете.

Известно, что тетрациклины ингибируют избыточную активность фосфолипазы А₂, вовлеченной в воспалительные состояния, такие как псориаз, как раскрыто в Патенте US 5532227. Кроме того, также известно, что тетрациклины ингибируют циклооксигеназу-2 (СОХ-2), фактор некроза опухоли (TNF), окись азота и IL-1 (интерлейкин-1).

Эти свойства делают тетрациклины полезными в лечении множества заболеваний. Например, существует множество предположений, что тетрациклины, включая неантимикробные тетрациклины, эффективны в лечении артрита. См, например, Greenwald et al. “Tetracyclines Suppress Metalloproteinase Activity in Adjuvant Arthritis and, in Combination with Flurbioprofen, Ameliorate Bone Damage,” Journal of Rheumatology 19:927-938 (1992); Greenwald et al. “Treatment of Destructive Arthritic Disorders with MMP Inhibitors; Potential Role of Tetracyclines in Inhibition of Matrix Metalloproteinases: Therapeutic Potential”, Annals of the New York Academy of Sciences 732:181-198 (1994); Kloppenburg et al. “Minocycline in Active Rheumatoid Arthritis,” Arthritis Rheum 37:629-636 (1994); Ryan et al. “Potential of Tetracycline to Modify Cartilage Breakdown in Osteoarthritis”, Current Opinion in Rheumatology 8:238-247 (1996); O’Dell et al. “Treatment of Early Rheumatoid Arthritis with Minocycline or Placebo,” Arthritis Rheum 40:842-848 (1997).

Предположили, что тетрациклины могут быть использованы для лечения кожных заболеваний. Например, White с соавт. (Lancet, Apr. 29, р.966 (1989)) сообщают, что тетрациклин миноциклин эффективен в лечении дистрофического врожденного буллезного эпидермолиза, который является жезнеопасным кожным заболеванием, связанным, как полагают, с избытком коллагеназы.

Кроме того, исследования также позволили предположить, что тетрациклины и ингибиторы металлопротеиназ ингибируют развитие опухоли (DeClerck et al., Annals N.Y. Acad. Sci, 732:222-232, 1994), резорбцию кости (Rifkin et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 732:165-180, 1994), ангиогенез (Maragoudakis et al., Br. J. Pharmacol, 111:894-902, (1994) и могут обладать противовоспалительными свойствами (Ramamurthy et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 732, 427-430, 1994).

На основе вышесказанного можно сделать вывод, что тетрациклины эффективны в лечении многочисленных заболеваний и состояний. Поэтому существует потребность в новых и еще более полезных производных тетрациклина.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соединения, раскрытые здесь, являются производными тетрациклина, которые проявляют антимикробную и/или противораковую активность.

В предпочтительной форме осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения, направленного на ингибирование микробного или опухолевого роста, включающему введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества тетрациклинового соединения или его соли общей формулы:

в которой R выбран из СН₂N(R_аR_b) или

R_aR_b представляют собой С₁-С₆-алкил;

R_c и R_d представляют собой (CH₂)_nCHR_e, n означает 0 или 1, и R_e представляет собой Н, С₁-С₆-алкил или NH₂, и Х представляет собой NH, S или СН₂;

R₁ представляет собой Н или ОН;

R₂ представляет собой Н, ОН, =O или OCOR₈, где R₈ представляет собой С₁-С₆-алкил, или альтернативно, R₂ представляет собой N(R₉)₂, где R₉ представляет собой водород или С₁-С₆-низший алкил, или R₉CO, при условии, что если R₂ представляет собой кетогруппу или N(R₉)₂, то R₂ и R₄ представляют собой Н или СН₃, и R₃ и R₄ не являются одновременно СН₃ или Н;

5а водород является – или -;

R₃ и R₄ представляют собой Н, СН₃ или F, при условии, что если R₃ представляет собой СН₃, то R₄ представляет собой Н или F, и если R₄ представляет собой СН₃, то R₃ представляет собой Н или F, и R₄ и R₅ не являются одновременно F;

R₅ и R₇ представляют собой галоген, Н, NO₂, N₃, N₂ ⁺, C₂H₅OC(S)S-, CN, NR₁₀R₁₁, где R₁₀ и R₁₁ представляют собой Н, C₁-С₁₀-алкил и R₁₂(CH₂)_nCO-, где n означает от 0 до 5, и R₉ представляет собой Н, NH₂, моно- или ди-замещенный амин, выбранный из прямой, разветвленной или циклической С₁-С₁₀-алкильной группы, при условии, что R₁₀ и R₁₁ не являются одновременно R₁₂(СН₂)_nСО-;

R₇, альтернативно, представляет собой четвертичный бутил; и

R₆ представляет собой галоген, ацетилен, R₁₃-C₆H₅, где R₁₃ представляет собой NO₂, галоген, ацетиламино, амино, фенил, алкил или алкокси.

В еще одной предпочтительной форме осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения, направленного на ингибирование микробного или опухолевого роста, включающему введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества тетрациклинового соединения или его соли общей формулы:

в которой R выбран из CH₂N(R_aR_b) или ;

где R_aR_b представляют собой C₁-C₆-алкил;

R_c и R_d представляют собой (CH₂)_nCHR_e, n означает 0 или 1, и R_e представляет собой Н, C₁-С₆-алкил или NH₂, и Х представляет собой NH, S или СН₂;

R₁ представляет собой Н или ОН;

R₂ представляет собой Н или ОН;

R₃ представляет собой Н или СН₃;

R₄ и R₆ представляют собой галоген, Н, NO₂, N₃, N₂ ⁺, C₂H₅OC(S)S-, CN, NR₇R₈, где R₇ и R₈ представляют собой Н, C₁-С₁₀-алкил и R₉(CH₂)_nCO-, где n означает от 0 до 5, и R₉ представляет собой Н, NH₂, моно- или дизамещенный амин, выбранный из прямого, разветвленного или циклического C₁-С₁₀-алкила, при условии, что R₇ и R₈ не являются одновременно R₉(CH₂)_nCO-; и

R₆ представляет собой Н или галоген, ацетилен, R₁₀-C₆H₅, где R₁₀ представляет собой NO₂, галоген, ацетиламино, амино, фенил, алкил или алкокси.

В еще одной предпочтительной форме осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения, направленного на ингибирование микробного или опухолевого роста, включающему введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества тетрациклинового соединения или его соли общей формулы:

в которой R выбран из CH₂N(R_aR_b) или ;

где R_aR_b представляют собой C₁-C₆-алкил;

R_c и R_d представляют собой (CH₂)_nCHR_e, n означает 0 или 1, и R_e представляет собой Н, C₁-C₆-алкил или NH₂, и Х представляет собой NH, S или СН₂;

R₁ и R₂ представляют собой Н или N(R₉)₂, где R₉ представляет собой Н или С₁-С₆-алкил при условии, что R₁ и R₂ не являются одновременно N(R₉)₂, R₁ и R₂ представляют собой также N(R₁₀)₃l, где R₁₀ представляет собой C₁-С₆-алкил, при условии, что R₁ и R₂ не являются одновременно N(R₁₀)₃l;

R₃ представляет собой Н;

R₄ и R₅ представляют собой Н, СН₃ или F, при условии, что если R₄ представляет собой СН₃, то R₅ представляет собой Н или F, и если R₅ представляет собой СН₃, то R₄ представляет собой Н или F, и R₄ и R₅ не являются одновременно F;

R₆ и R₈ представляют собой галоген, Н, NO₂, N₃, N₂ ⁺, C₂H₅OC(S)S-, CN, NR₁₁R₁₂, где R₁₁ и R₁₂ представляют собой Н, C₁-С₁₀-алкил и R₁₃(CH₂)_nCO-, где n означает от 0 до 5, и R₁₃ представляет собой Н, NH₂, моно- или дизамещенный амин, выбранный из прямых, разветвленных или циклических C₁-С₁₀-алкильных групп, при условии, что R₁₀ и R₁₁ не являются одновременно R₁₂(СН₂)_nСО-; и R₈ может быть также четвертичным бутилом, и R₇ представляет собой Н или галоген.

В дополнительной предпочтительной форме осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения, направленного на ингибирование микробного или опухолевого роста, включающему введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества тетрациклинового соединения или его соли общей формулы:

– или -;

R₄ и R₅ представляют собой Н, СН₃ или F, при условии, что если R₄ представляет собой СН₃, то R₅ представляет собой Н или F, и если R₅ представляет собой СН₃, то R₄ представляет собой Н или F, и R₄ и R₅ не являются одновременно F;

R₆ и R₈ представляют собой галоген, Н, NO₂, N₃, N₂ ⁺, C₂H₅OC(S)S-, CN, NR₁₀R₁₁, где R₁₀ и R₁₁ представляют собой Н, алкил(C₁-С₁₀) и R₁₂(СН₂)_nСО-, где n означает от 0 до 5, и R₁₂ представляет собой Н, NH₂, моно- или дизамещенный амин, выбранный из прямых, разветвленных или циклических C₁-C₁₀-групп, при условии, что R₁₀ и R₁₁ одновременно представляют собой R₁₂(CH₂)_nCO-, или, альтернативно, R₈ представляет собой четвертичный бутил;

R₇ представляет собой Н или галоген, ацетилен, R₁₂-C₆H₅, где R₁₂ представляет собой NO₂, галоген, ацетиламино, амино, фенил, алкил или алкокси.

В еще одной предпочтительной форме осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения, направленного на ингибирование микробного или опухолевого роста, который включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества тетрациклинового соединения или его соли общей формулы:

-казеина (Sigma), как описано в Methods in Enzymology 248, 451 (1995).

Составляющие анализа:

100 мкг ¹⁴С-казеина (7000 dpm)

50 мМ Трис-HCl, рН 7,9

15 мМ CaCl₂, 0,02% азида

Рекомбинантная ММР3 человека, 0,25-1,0 нМ

±тетрациклин (до 1 мМ) в общем объеме 250 мкл.

Инкубации проводили при 37°С в течение 16 часов. Реакцию останавливали добавлением 500 мкл холодной 18%-ной ТХУ и выдерживанием на льду в течение 15 минут. ТХУ-преципитаты удаляли центрифугированием при 10000 g в течение 10 минут при 4°С, и 200 мкл супернатанта брали для сцинтилляционного подсчета. Использовали только данные, полученные в пределах линейной части анализа (10-60% лизиса). Процентное ингибирование ММР3 каждой концентрацией тетрациклина-кандидата наносили на график, для того чтобы получить величину IC₅₀, используя линейный регрессивный анализ.

4. Протокол измерения ингибирования ММР7 (матрилизина)

Активность ММР7 определяли по высвобождению ТХУ-растворимых фрагментов из ¹⁴С ацетилированного -казеина (Sigma), как описано в Methods in Enzymology 248, 451 (1995).

Составляющие анализа:

100 мкг ¹⁴С-казеина (7000 dpm)

50 мМ Трис-HCl, рН 7,9

15 мМ CaCl₂, 0,02% азида

Рекомбинантная ММР7 человека, 1,5 нМ

± тетрациклин (до 1 мМ) в общем объеме 250 мкл.

Инкубации проводили при 37°С в течение 16 часов. Инкубацию останавливали добавлением 500 мкл холодной 18%-ной ТХУ и выдерживанием на льду в течение 15 минут. ТХУ-преципитаты удаляли центрифугированием при 10000 g в течение 10 минут при 4°С, и 200 мкл супернатанта брали для сцинтилляционного подсчета. Использовали только данные, полученные в пределах линейной части анализа (10-60% лизиса). Процентное ингибирование ММР7 каждой концентрацией тетрациклина-кандидата наносили на график, для того чтобы получить величину IC₅₀.

5. Протокол измерения ингибирования ММР9 (желатиназы В)

Активность ММР9 определяли по высвобождению ТХУ-растворимых фрагментов из ¹⁴С-ацетилированного коллагена I типа из кожи крысы (Methods in Enzymology 248, 470, 1995; Biochem. J. 195, 1981)

Составляющие анализа:

100 мкг ¹⁴С-меченного желатина (коллагена, денатурированного при 60°С в течение 20 мин)

50 мМ Трис-HCl, рН 7,9

15 мМ CaCl₂, 0,02% азида

Рекомбинантная ММР9 человека, 1,2-2 нМ

±Тетрациклин (до 1 мМ) в общем объеме 250 мкл.

Инкубации проводили при 37°С в течение 16 часов. Инкубации останавливали охлаждением инкубации и добавлением 50 мкл холодной 90%-ной (масса/объем) трихлоруксусной кислоты при осторожном перемешивании. ТХУ-преципитацию продолжали в течение 15 минут при 4°С перед центрифугированием при 10000 g в течение 10 минут при 4°С. 200 мкл ТХУ-супернатанта брали для определения содержания радиоактивности с помощью сцинтилляционного счетчика (сцинтилляционная жидкость Packard Opti Phase Supermix). Использовали только данные, полученные в пределах линейной части анализа (10-70% лизиса). Процентное ингибирование ММР9 каждой концентрацией тетрациклина наносили на график, для того чтобы получить величину IC₅₀.

6. Протокол измерения ингибирования ММР14 (MTI-MMP) производными тетрациклина

Активность ММР14 определяли по высвобождению растворимых ¹⁴С-меченых фрагментов коллагена из ¹⁴С-ацетилированного коллагена I типа из кожи крысы (Methods in Emymology 80, 711, 1981).

Составляющие анализа:

100 мкг ¹⁴С-меченого коллагена (5-6000 dpm)

50 мМ Трис-HCl, рН 7,9

15 мМ CaCl₂ 0,02% азида

Человеческий рекомбинантный ММР14 50-100 нМ

± Тетрациклин (до 1 мМ) в общем объеме 300 мкл.

Инкубации проводили при 35°С в течение 15 часов. Нерасщепленные фибриллы коллагена, которые образуются в течение первых 10 минут, удаляли центрифугированием при 10000 g, 4°С, 10 минут. 200 мкл супернатанта просчитывали в сцинтилляционной жидкости Packard Opti Phase Supermix с помощью сцинтилляционного счетчика. Использовали только данные, полученные в пределах линейной части анализа (10-70% лизиса коллагена). На основании процентного ингибирования активности только ММР1 диапазоном концентраций каждого образца рассчитывали величину IC₅₀ для каждого тетрациклина.

Другая цель состояла в том, чтобы проанализировать in vitro эффекты специфических, тетрациклин-производных соединений на хемоинвазивный потенциал следующих клеточных линий:

С8161, клетки меланомы человека

MDA-MB-231, клетки рака молочной железы человека

РС3, клетки рака простаты человека

RPMI-8226, клетки миеломы человека

Ark, клетки миеломы человека

Arp-1, клетки миеломы человека

Хемоинвазивный анализ in vitro с мембранной инвазивной культуральной системы (МИКС) был выбран, для того чтобы измерить изменения в инвазивном потенциале специфических раковых клеток человека в ответ на тетрациклин-производные соединения. Маточные растворы каждого соединения гидратировали в воде, содержащей 2% ДМСО, с рН 10,0. После солюбилизации к раствору добавляли HCl для установления рН 7,5-8,0. Затем этот раствор заворачивали в фольгу и хранили при 4°С в течение 24 часов анализа. Для каждого анализа приготавливали свежее соединение. Анализы по хемоинвазии in vitro для определения инвазивности опухолевых клеток выполняют с помощью мембранной инвазивной культуральной системы (МИКС), как описано ранее.

МИКС-система представляет собой термически обработанную пластиковую разветвленную (коллекторную) систему, состоящую из двух подогнанных комплектов чашек, содержащих четырнадцать лунок с диаметром 13 мм. Между этими чашками был размещен поликарбонатный фильтр, содержащий 10 мкм поры и покрытый определенным матриксом, состоящим из человеческого ламинина, коллагена IV, желатина, образующих барьер толщиной 35 мкм между верхней и нижней частями лунок в МИКС. До помещения этого барьера на место нижние лунки заполняли бессывороточной культуральной средой RPMI, сделанной на 50% из кондиционированной среды, полученной от 2-дневных культур фибробластов человека, которая была очищена от клеток и клеточного дебриса либо центрифугированием, либо фильтрацией через 0,45 мкм стерильный фильтр. Затем в нижние лунки помещали барьер, и после сборки системы в верхние лунки добавляли свежую бессывороточную среду. Затем в лунки добавляли пятьдесят тысяч опухолевых клеток либо в присутствии соединения, либо в присутствии носителя ДМСО (контроли). Из 12 аналитических лунок в каждом коллекторе 3 случайным образом выбранные лунки служили в качестве контролей, 3 лунки содержали 1 мкг/мл соединения, 3 лунки – 10 мкг/мл и 3 лунки – 25 мкг/мл. Через 24 часа из нижних лунок удаляли клетки и среду и заменяли фосфатно-солевым буфером плюс 2 мМ ЭДТА. Этот раствор использовали для удаления всех клеток из нижней лунки, и эту промывку добавляли к полученным клеткам плюс среда из той же лунки. Эти образцы затем собирали на полилизин-содержащую поликарбонатную мембрану, содержащую 3 мкм поры, используя дот-блот коллекторную систему. Эти коллектор-фильтры затем фиксировали в метаноле и окрашивали in situ с помощью красителя Райта (набор для окрашивания Leukostat). Затем фильтры помещали на предметные стекла для микроскопа с иммерсионным маслом для микроскопии, которое уменьшало преломление света от пор, и просчитывали 5 микроскопических полей для расчета количества клеток, которые проникли через мембрану в течение 24 часов. Эти числа затем статистически анализировали, как описано ниже.