Патент на изобретение №2300107

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к производству и использованию биопрепаратов, предназначенных для дифференциальной диагностики бруцеллеза, и к способу дифференциальной диагностики бруцеллеза. Способ заключается в серологическом анализе сывороток в ИФА с использованием антигенного ИФК, представляющего собой меченую пероксидазой хрена электрофоретически очищенную полипептидную фракцию вирулентного штамма B.abortus 54. Диагноз на бруцеллез ставят при обнаружении в сыворотках больных животных противобруцеллезных антител в разведениях 1/100 и выше при степени интенсивности реакции Ксп 2,1 и выше. Технический результат: разработка способа, повышающего специфичность ИФА теста и позволяющего проводить дифференциацию поствакцинальных иммунологических реакций от постинфекционных, а также дифференциацию перекрестных реакций, индуцированных микроорганизмами, имеющими антигенные родство с бруцеллами, особенно Yersinia entericolitica, 2 н.п. ф-лы.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”competitive enzyme-linked immunosorbent assay to improve the serological diagnosis of brucellosis”, Clin.Diagn.Lab.Immunol. 1996 May; V.3,. №3, P.309-314.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к получению и производству препаратов, предназначенных для дифференциальной диагностики бруцеллеза.

Известно несколько способов серологической и дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. Это такие, как реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция длительного связывания комплемента (РДСК), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), роз-бенгал проба (РБП) и другие.

Недостатком этих методов является отсутствие строгой специфичности этих тест-систем, поскольку во многих случаях у животных выявляются реакции, не связанные с развитием инфекционного бруцеллезного процесса. Это связано с тем, что в качестве основного иммунологического компонента в этих тест-системах применяется единый бруцеллезный антиген, вступающий в реакцию как с S-, так RS-антителами, присутствующими как у больных бруцеллезом, так и привитых противобруцеллезными вакцинами, а также у животных – носителей иерсиний – Y.enterocolitica.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является ИФА (иммуноферментный анализ), при котором для дифференциальной диагностики бруцеллеза проводят серологическую индикацию бруцелл в объектах ветеринарного надзора с использованием моноклональных антител (МКА). При этом в сенсибилизированные бруцеллезным антигеном планшеты вносят моноклональные антитела, а после выдержки при температуре 37-38°С в течение 1 часа добавляют антивидовой иммуноферментный конъюгат. О наличии антигенов в испытуемой пробе судят по степени интенсивности окраски содержимого лунок. Реакцию считают положительной при интенсивности окраски 2-4 креста в разведениях 1/16-1/32. (Плотникова Э.М., Салмаков К.М. – Разработка методов и средств иммуномониторинга бруцеллеза животных. – Ветеринария. – 2003. – №12. – С.16-18.)

Однако дифференциальная диагностика бруцеллеза с использованием ИФА-теста путем индикации возбудителя бруцеллеза (бруцеллезного антигена) сопряжена с технологическими трудностями, ибо процесс индикации возбудителя представляет весьма трудоемкую и сложную задачу, поскольку для обнаружения возбудителя необходимо проводить подготовку проб к исследованию, накопление бактериальной биомассы, обработку антигенного материала и постановку ИФА.

Недостатком этого способа является сложность и дороговизна получения МКА для ИФА, длительная и многоэтапная подготовка к исследованию, накопление бактериальной биомассы, обработка антигенсодержащего материала и т.д. При этом искомый агент может быть и не выделен, поскольку результат предварительной бактериологической индикации при малом количестве микробов в исследуемых пробах (менее 10⁴ микробных клеток на 1 г (мл) пробы) может быть отрицательным, что снижает чувствительность и эффективность серологической диагностики бруцеллеза. При этом способе не достигается главной цели – дифференциации вирулентных штаммов возбудителя от авирулентных и вакцинных вариантов бруцелл, что связано с использованием антигена R-форм бруцелл для гипериммунизации животных-доноров специфических антител.

Задачей изобретения является разработка способа, повышающего специфичность ИФА-теста и позволяющего проводить дифференциацию поствакцинальных иммунологических реакций от постинфекционных, а также дифференциацию перекрестных реакций, индуцированных микроорганизмами, имеющими антигенные родство с бруцеллами, особенно Yersinia entericolica.

Поставленная задача решается за счет использования серологического анализа сывороток крови исследуемых животных в иммуноферментном анализе (ИФА), который проводят с использованием антигенного варианта иммуноферментного конъюгата (АГ ИФК), в котором в качестве специфического индикаторного компонента используют полипептидную фракцию вирулентного штамма B.abortus 54 с молекулярной массой 41,8 кДа, отсутствующую у вакцинных (B.abortus 19,82, R-1096) и других вирулентных видов (B. suis, В. obis) бруцелл, и по феномену иммуноферментной реакции судят о наличии специфических постинфекционных антител в исследуемых сывороток, по степени интенсивности реакции (Ксп) и по титру постинфекционных антител в ИФА ставят дифференциальный диагноз на бруцеллез, за диагностический титр постинфекционных антител принимают положительную реакцию в разведениях исследуемых сывороток 1:100 и выше с коэффициентом специфичности (Ксп)-2,1 и выше.

Сущность изобретения заключается также в том, что способ получения антигенного варианта иммуноферментного конъюгата (АГ ИФК) для дифференциации постинфекционных антител от поствакцинальных включает радиоинактивацию бруцелл с последующим лизированием их, выделение специфической антигенной фракции вирулентного штамма B.abortus 54 электрофоретическим методом в полиакриламидном геле (ПААГ) в градиенте концентрации 10-20% в присутствии додецилсульфата Na (SDS), силе тока 80 мА и экспозиции 2,5-3,0 часа, фиксацию пластин геля в растворе, содержащем 40% изопропилого спирта и 10% уксусной кислоты, с последующим окрашиванием геля в 0,1% растворе кумасси бриллиантовым голубым R-250, дополнительным окрашиванием полипептидных фракций серебром с использованием раствора формальдегида, определение молекулярных масс фракционированных полипептидов с использованием калибровочного графика, составленного на основе стандартных маркеров: БСА (67кДа), ЕА (43кДа) и цитохрома С (12,3 кДа), перенос антигенных фракций с пластин ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану (“Miliipore”) с буфером, содержащем 0,024 М трис, 0,076 М глицин и 20% метанола при помощи графитовых пластин (3 часа при 100 мА). Для выявления специфической фракции после фиксации нитроцеллюлозную мембрану обрабатывают гипериммунными сыворотками кроликов пероксидазным конъюгатом и раствором субстрата (бензидин HCI).

Специфическую полипептидную антигенную фракцию, полученную после очистки указанными компонентами и имеющую молекулярную массу 41,8 кДа, конъюгируют (сшивают) с ферментной меткой (пероксидазой хрена) из расчета 1 мг фермента на 5 мг полипептида, используя перйодатный метод (Иммуноферментный анализ. /Под ред. Г.Г.Нго, Г.М.Ленхофф. – М. – 1988. – с.240-243).

Полученный противобруцеллезный антигенный иммуноферментный конъюгат (АГ ИФК) консервируют или подвергают лиофильной сушке. Существенным отличием способа дифференциации постинфекционных от поствакцинальных и гетерологичных (иерсиниозные) антител является то, что для этой цели используют высокоспецифическую чувствительную тест-систему (ИФА) на основе моноспецифического индикаторного компонента – меченную пероксидазой изолированную из вирулентного штамма B. abortus 54 полипептидную фракцию с мм. 41,8 кДа, отсутствующую у вакцинных (19,82, R-1096) штаммов бруцелл и гетерологичных микроорганизмов (иерсиний).

Способ дифференциальной диагностики бруцеллеза и способ получения диагностического препарата осуществляется следующим образом.

Начальным этапом изготовления диагностического препарата – меченного ферментом пероксидазой хрена специфического антигена бруцелл, является выделение моноспецифической полипептидной антигенной фракции вирулентного штамма бруцелл, отсутствующей у авирулентных и вакцинных штаммов бруцелл, которая служит основным иммунологическим индикаторным компонентом антигенного диагностикума – противобруцеллезного иммуноферментного конъюгат (ИФК).

Моноспецифическую полипептидную антигенную фракцию бруцелл получают путем электрофоретического разделения лизатов бруцелл, предварительно инактивированных гамма-лучами ⁶⁰Со в дозе 3,0-3,5×10⁴ Гр.

Для этой цели берут вирулентные штаммы видов B.abortus (54,544), B.suis (1330, S-40, 0302, 0303), B.canis (RM 6/66), В. melitensis (16M), В. obis (101, 31) и вакцинные штаммы бруцелл (19, УФ-1,82, R-1096), выращивают их на печеночно-пептонной среде в течение 24 ч, полученную бакмассу отделяют центрифугированием и разводят физиологическим раствором до концентрации 1·10⁹ м.к./см³ и подвергают лучевой инактивации (радиоинактивации) на гамма-установке с источником излучения ⁶⁰Со в дозе 3,0,-3,5×10⁴ Гр.

Радиоинактивированные бруцеллы лизируют в растворе, приготовленном на 0,062-0,125 М трис HCl-буфере, рН 6,8, и содержащем 2-5% додецилсульфата натрия (SDS) и 5% -меркаптоэтанола. Бактериальные клетки в лизирующем растворе прогревают на кипящей водяной бане в течение 1 мин, затем к пробам приливают глицерин с бромфеноловым синим до конечной концентрации 10% и 0,001% соответственно. Для проведения диск-электрофореза пробы в лунки концентрирующего геля наносят в количестве 50-100 мкг по белку. Режим электрофореза до вхождения красителя в разделяющийся гель составляет 40 мА на 2 пластины геля. Дальнейший электрофорез проводят при силе тока 80 мА на 2 пластины геля в течение 3-3,5 часов. Пластины геля по окончании электрофореза фиксируют в растворе, содержащем 40% изопропилового спирта и 10% уксусной кислоты, в течение 1 часа или оставляют на ночь. Гели окрашивают в 0,1%-ном растворе “кумасси”. Окраску фракционированных в ПААГ полипептидов серебром проводят согласно методу Э.И.Гребиножко и др. /Простой метод обнаружения белков в полиакриламидном геле с помощью импрегнации их серебром. – Украинск. биохим. журнал. – 1986 – Т.58, №5. – С.62-65/ с использованием раствора формальдегида. Денситотометрирование пластин гелей производят на сканере Sharp 330 Yx в проходящем свете. Определение молекулярных масс и расчет процентного содержания белковых (антигенных) фракций осуществляют по программе Imayemachn 1 D prime.

При анализе электрофореграмм после разгонки лизатов исследуемых штаммов бруцелл в градиенте 15-20% ПААГ у вирулентного штамма 54 обнаруживают более широкий набор полипептидов (до 59 фракций) по сравнению со всеми другими штаммами и видами бруцелл, у которых количество их колеблется в пределах от 29 до 49 фракций с молекулярной массой (м.м.) от 20 до 60 кДа. При сопоставительном анализе электрофореграмм всех испытанных видов и штаммов у B. abortus 54 закономерно обнаруживают полипептидную фракцию с молекулярной массой 41,8 кДа, отсутствующую у других видов и штаммов бруцелл, что имеет принципиальнее значение для использования этого компонента для конструирования специфического диагностикума.

Для выявления серологической активности и иммунологической компетентности фракций бруцелл после фиксации нитроцеллюлозную мембрану обрабатывают соответствующими гипериммунными кроличьими S-, SR-, R- сыворотками к антигенам использованных в опытах штаммов и видов бруцелл.

Антигенную фракцию, проявляющую наиболее высокую серологическую активность и специфичность, т.е. вступающую в иммунологическую реакцию только с антисыворотками к вирулентным штаммам вида B. abortus bovis, изолируют и используют в дальнейшем для изготовления антигенного противобруцеллезного иммуноферментного конъюгата (АГ ИФК).

Для приготовления АГ ИФК антигенную фракцию из шт.54, изолированную вышеописанным способом, подвергают конъюгированию (сшивке) с ферментом периодатным методом. В качестве метки используют пероксидазу хрена, а мечение антигена осуществляют следующим образом.

Предварительно пероксидазу хрена растворяют в дистиллированной воде до конечной концентрации 5 мг/мл. Концентрацию фермента в растворе и степень чистоты фермента контролируют спектрофотометрически, определяя показатель чистоты (Rz) и концентрацию фермента в растворе по формуле:

С_ПХ мг/мл: Р.=Д₄₃₀/Д₂₈₀

С_ПХ мг/мл=Д₄₀₃×0,44 разв. образца,

где Д₄₀₃, Д₂₈₀ – оптическая плотность раствора, измеренная на спектрофотометре при длине волн 403 нм и 280 нм соответственно;

0,44 – коэффициент пересчета.

К раствору фермента добавляют 0,1 н. водный раствор натрия метапериодата (21,4-1 мл д.в.) из расчета по 0,2 мл на каждые 5 мг пероксидазы.

Смесь выдерживают при 18-24°С 20 мин, встряхивая, и далее диализуют против ацетатного буфера рН 4,4 в течение суток с трехкратной сменой буферного раствора при соотношении, равном 1:500.

По окончании диализа раствор фермента декантируют из диализного мешочка, проверяя рН, которая должна быть в пределах 4-4,5, и хранят при 0-4°С при соотношении объема раствора фермента буферного раствора, равном 1:500.

К полученному раствору модифицированный пероксидазы добавляют 0,2М карбонат-бикарбонатный буфер рН 9,5-10,0 (к 1 мл раствора фермента добавляют 0,1-0,15 мл буфера) до установления рН в растворе фермента 9,5-9,7, после чего немедленно добавляют к нему прогретые при 56°С в течение 30 мин фракции в объеме не более 1 мл, содержащем количество белка, в 4 раза превышающее количество пероксидазы (то есть на каждые 5 мг пероксидазы брали 20 мг фракции). Объем антигенной фракции доводят до 1 мл 0,01М карбонат-бикарбонатным буфером рН 9,5. Концентрацию белка определяют по формуле:

К=Д₂₈₀ × а (разведение образца)/1,3,

где 1,3 – постоянный коэффициент расчета. Смесь выдерживают после проверки рН (которая должна быть в пределах 9,5-10,0) при 18-24°С, при постоянном встряхивании в течение 2 часов, после чего ее диализуют против 500-кратного объема 0,01 М фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,2-7,4 при 4°С в течение суток с 2-3-кратной сменой буфера.

Меченную ферментом антигенную фракцию – иммуноферментный конъюгат – консервируют добавлением мертиолята до конечной концентрации 1:100000 в растворе препарата и хранят в нативном виде в условиях холодильника.

Полученный вышеописанным способом антигенный вариант противобруцеллезного иммуноферментного конъюгата проверяют на активность и специфичность с использованием прямого метода иммуноферментного анализа (ИФА). При этом в качестве положительного контроля используют сыворотки заведомо больных бруцеллезом животных, а в качестве отрицательного контроля – сыворотки интактного и привитого против указанной болезни животных, а в качестве гетерологичного контроля – сыворотки носителей бруцелл B. suis, B. canis, В. obis. Положительная реакция с сывороткой больных бруцеллезом животных с максимальным титром в разведении 1:100 и отрицательная реакция с сыворотками привитых противобруцеллезными вакцинами и контаминированных гетерологичными антителами животных свидетельствует о специфичности и активности полученных иммуноферментных конъюгатов.

Постановку дифференциального диагноза на бруцеллез крупного рогатого скота (КРС) осуществляют следующим образом. У обследуемых животных берут кровь из яремной вены в объеме 10 см³ и получают сыворотку общепринятым методом.

Полученную сыворотку используют в качестве антител в прямом варианте ИФА, постановку и оценку результатов которого проводят в соответствии с методическими рекомендациями Х.Фремеля и Г.Хольцхайдта (“Иммунологические методы”, М., 1987, с.162-170).

В качестве специфического антигена в прямом варианте ИФА используют полученный по вышеописанному способу антигенный вариант иммуноферментного конъюгата (АГ ИФК).

Реакцию сопровождают следующими контролями:

– сыворотка интактных (здоровых, непривитых животных);

– сыворотка привитых шт.19 животных;

– сыворотка привитых шт.R-1096 животных;

– сыворотка носителей Y. enterocolitica;

– сыворотка контаминированных шт.B. suis;

– сыворотка контаминированных шт.B. bovis;

– сыворотка контаминированных шт.B. melitensis.

За положительную реакцию ИФА принимают разведение 1:100 с коэффициентом специфичности (Ксп) – 2,1 и выше при отрицательной реакции с гетерологичными и общегрупповыми сыворотками (от привитых бруцеллезными вакцинами и другими видами бруцелл).

Положительная реакция ИФА с использованными сыворотками в разведениях 1:100 и выше (коэффициент специфичности Ксп – 2,1 и выше) свидетельствует о наличии в организме обследуемых животных вирулентного штамма бруцелл вида B. abortus.

Способ дифференциальной диагностики бруцеллеза апробирован на лабораторных (морских свинках и кроликах) и комиссионно на сельскохозяйственных (крупном рогатом скоте) животных в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах.

Способ дифференциальной диагностики бруцеллеза и способ получения препарата для ее осуществления иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Получение специфической антигенной фракции B. abortus.

Бруцеллезный антиген получали общепринятыми методами путем термоэкстрагирования бруцелл, ультразвукового разрушения, гамма-облучения, этанолового и фенолового экстрагирования, лизирования клеток с последующим гель-электрофорезом в полиакримидном геле (ПААГ). Спектрометрический анализ полученных антигенов показал, что они содержат не более 2-3 основных фракций антигенов, которые вступали в серологические реакции как с S-, SR-, так и с R- сыворотками, полученными как от носителей видов бруцелл В. abortus, В. suis, В bovis, В canis, В melitensis, так и от иммунизированных противобруцеллезными вакцинами животных. Использование для этой цели методов радиоинактивации, разрушения клеток в лизирующем растворе с последующим гель-электрофорезом в ПААГ обеспечивает выделение строго специфичного компонента B. abortus 54, который вступал в реакцию ИФА только с антисыворотками контаминированных вирулентными штаммами вида B. bovis.

Пример 2. Получение антигенного иммуноферментного конъюгата.

Иммуноферментный конъюгат получали путем сшивки антигенной фракции бруцелл шт.54 с иммуноферментной меткой-ферментом пероксидазой хрена в соотношении антигена (белка) и метки 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 при режимах конъюгирования 5, 10, 15, 20, 25 мин.

При этом установлено, что оптимально время конъюгирования составило 20 минут, а соотношение антигена и метки – 1:20.

Изменение режимов конъюгирования (соотношения компонентов, времени конъюгирования, сшивки, метки и другие параметры) не обеспечивало получения конъюгатов с достаточной серологической активностью, ибо титр антигенов при этом не превышал 1:30.

Пример 3. Эффективность способа дифференциации постинфекционных антител от поствакцинальных испытывали на морских свинках. С этой целью 40 морских свинок подвергали заражению вирулентными штаммами возбудителя бруцеллеза B. abortus 54 (1-я), 99 (2-я), 544-(3-я) группа (по 5 животных на каждый штамм), иммунизированными вакцинными штаммами 19 (4-я), 82 (5-я) и R-1096 (6-я) (по 5 морских свинок на каждый вариант вакцины), а также заражали возбудителем иерсиниоза (Y. enterocolitica) (7-я группа); 8-ю группу животных не иммунизировали и не заражали (биологический контроль). У всех животных в динамике (через 3, 7, 14, 21 и 28 сутки после введения антигенов бруцелл) брали пробы крови для серологического исследования в ИФА. Установлено, что во все сроки исследования у контрольных и иммунизированных животных (4-я, 5-я, 6-я, 7-я и контрольная группы) антитела не были выявлены. В отличие от иммунизированных у зараженных вирулентными штаммами возбудителя бруцеллеза (1-я, 2-я, 3-я группы) были обнаружены противобруцеллезные антитела в титрах от 1:4-1:8, 1:16-1:32, 1:64-1:128 на 7, 14, 21 и 28 сутки после заражения соответственно. При параллельном исследовании испытуемых сывороток в PA, PCK и РИГА у всех иммунизированных и зараженных вирулентными штаммами бруцелл были выявлены антитела в титрах 1:10-1:50 на 14, 21 и 28 сутки после заражения и иммунизации. При этом ни по титру, ни по срокам появления антител дифференцировать их по классу, т.е. поствакцинальные или постинфекциональные, не представлялось возможным.

Пример 4. Эффективность предлагаемого способа дифференциальной диагностики бруцеллеза и возможность дифференциации больных бруцеллезом животных от вакцинированных проверяли на крупном рогатом скоте в благополучных, привитых штаммами 19 и 82, а также в не благополучных по бруцеллезу КРС хозяйствах Тульской области и Республики Татарстан. Установлено, что результаты регламентированных при бруцеллезе тест-систем (РА, PCK, РБП) с использованием известного диагностикума (единого бруцеллезного антигена) не позволяли дифференцировать больных бруцеллезом животных от вакцинированных, поскольку сыворотки как вакцинированных, так и спонтанно зараженных животных реагировали положительно с известным антигеном. В отличие от общепринятых тест-систем предлагаемая тест-система (ИФА) с использованием предлагаемого диагностикума (иммуноферментный конъюгат на основе полипептидной фракции бруцелл из шт.54) позволяла идентифицировать сыворотки больных бруцеллезом от привитых против этой болезни животных.

Формула изобретения

1. Способ дифференциальной диагностики больных бруцеллезом животных от вакцинированных, характеризующийся тем, что проводят серологический анализ сывороток крови животных в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием антигенного противобруцеллезного иммуноферментного конъюгата, представляющего собой меченную пероксидазой хрена электрофоретически очищенную в полиакриламидном геле полипептидную антигенную фракцию вирулентного штамма В. abortus 54 с молекулярной массой 41,8 кДа, и дифференцируют больных бруцеллезом животных от вакцинированных при обнаружении в сыворотках у больных животных противобруцеллезных антител в разведениях 1/100 и выше при степени интенсивности реакции Ксп.2,1 и выше и при отсутствии противобруцеллезных антител в сыворотках у вакцинированных.

2. Способ получения противобруцеллезного антигенного иммуноферментного конъюгата (ИФК) для дифференциальной диагностики больных бруцеллезом животных от вакцинированных, характеризующийся тем, что вирулентный штамм бруцелл вида В. abortus 54 инактивируют гамма-лучами ⁶⁰Со в дозе 3,0-3,5×10⁴ Гр, лизируют в растворе, приготовленном на 0,062-0,125 М трис HCL-буфере, рН 6,8, содержащем 2-5% додецилсульфата натрия и 5% -меркаптоэтанола, наносят пробы в лунки концентрирующего геля в количестве 50-100 мкг по белку, проводят электрофорез при силе тока 40 мА на две пластины геля до вхождения красителя в гель и затем при силе тока 80 мА на две пластины 3-3,5 ч, фиксируют пластины в растворе, содержащем 40% изопропилового спирта и 10% уксусной кислоты в течение 1 ч, окрашивают в 0,1%-ном растворе “кумасси” бриллиантовым голубым R-250, затем фракции полипептидов окрашивают серебром с использованием раствора формальдегида, денситометрируют пластины геля на сканере SHARP-330Y х в проходящем свете, определяют молекулярную массу и иммунологическую компетентность фракций методом иммуноблотинга, полипептидную антигенную фракцию вирулентного штамма бруцелл В. abortus 54 с молекулярной массой 41,8 кДа конъюгируют с ферментной меткой – пероксидазой хрена из расчета 1 мг белка на 20 мг пероксидазы при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 20 мин.