Патент на изобретение №2299908

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ BORDETELLA PERTUSSIS

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к молекулярно-генетическому типированию штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, выявлению эпидемических штаммов и созданию на их основе перспективных вакцинных препаратов. Описан способ дифференциации штаммов В.pertussis no ptxS1 гену, предусматривающий выделение ДНК из штаммов В.pertussis. Затем выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременным введением праймеров S1-F2 5-CCCCCTGCCATGGTGTGATC-3 и S1-R2 5-AGAGCGTCTTGCGGTCGATC-3 и получением ампликонов фрагмента гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина (ptxS1), которые подвергают последовательно рестрикции эндонуклеазами Ehe I и Bfu I и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле. Затем проводят дифференциацию путем сравнения размера ампликонов фрагментов ДНК ptxS1 гена исследуемых штаммов В.pertussis с контрольными образцами ДНК штаммов В.pertussis, имеющими ptxS1A, ptxS1B, ptxS1D и ptxS1E аллелей гена. Способ точный, ускоренный и экономически выгодный. Использование способа позволит выявить эпидемические штаммы с особенностями генетической структуры ptxS1 гена и создать на их основе эффективные вакцинные препараты, обладающие высокой протективной активностью в отношении циркулирующих штаммов В.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к молекулярно-генетическому типированию штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, выявлению эпидемических штаммов и созданию на их основе перспективных вакцинных препаратов.

Основная задача молекулярно-генетического типирования штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, в частности в отношении возбудителей инфекций, управляемых средствами специфической иммунопрофилактики, – это выявление эпидемических штаммов с особенностями генетической структуры, которая отличается от структуры штаммов, используемых для производства вакцинных препаратов. Данные эпидемические штаммы могут способствовать сохранению возбудителя заболевания в иммунной популяции и вызывать рост заболеваемости этой инфекцией не только среди непривитых, но привитых против данной инфекции лиц. На основе таких штаммов могут быть созданы перспективные эффективные вакцинные препараты.

В последние годы в различных странах мира отмечается рост заболеваемости коклюшем среди детей школьного возраста, несмотря на высокий охват прививками детей раннего возраста. Одной из причин роста заболеваемости коклюшем является изменение генетической структуры возбудителя заболевания под влиянием массовой иммунизации (1, 2, 3, 5, 7). В настоящее время во многих странах мира проводятся исследования по изучению особенностей генетической структуры различных генов у штаммов Bordetella pertussis (В.pertussis). В первую очередь внимание обращено на изучение одного из основных протективных антигенов коклюшного микроба – коклюшный токсин и ген, кодирующий его ферментоактивную субъединицу S1 (ptxS1) (8). Для молекулярно-генетического типирования штаммов В.pertussis используется большое количество методов, таких как секвенирование, пульс-электрофорез, мультилокусное секвенирование, полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами и др. (1, 3, 5, 8). В результате многочисленных исследований выявлен полиморфизм в гене, кодирующем S1 субъединицу коклюшного токсина (ptxS1). У штаммов B.pertussis обнаружены четыре аллели этого гена – ptxS1А, ptxS1В, ptxS1D и ptxS1Е. Показано, что в организме детей, вакцинированных цельноклеточной вакциной, происходит селекция антигенно измененных аллелей, отличающихся по антигенной специфичности от вакцинных штаммов B.pertussis. Невакцинная аллель ptxS1 гена (ptxS1A аллель) постепенно вытесняет ранее циркулировавшие «вакцинные» аллели гена – ptxS1В и ptxS1D (3, 4, 5, 6, 7,9).

Недостатками данных методов типирования является то, что они трудоемкие и дорогостоящие, требуют наличия специального и дорогого оборудования и не могут быть использованы для изучения генетического полиморфизма большого числа штаммов B.pertussis и быстрого создания на их основе новых вакцинных препаратов, эффективных в отношении циркулирующих штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем.

Принимая во внимание, что в настоящее время иммунизация детей в нашей стране и в других странах мира осуществляется на основе «старых» вакцинных штаммов, выделенных еще в 50-60-е годы, обсуждается вопрос о необходимости создания системы слежения за генетической структурой («антигенным дрейфом») возбудителя коклюша с использованием ускоренных и доступных методов молекулярно-генетического типирования для выявления эпидемических штаммов, вызывающих заболевание коклюшем, и создания на их основе перспективных вакцинных препаратов (1, 2).

Задачей настоящего изобретения является разработка точного, ускоренного, простого и экономически выгодного способа дифференциации штаммов B.pertussis с различной структурой ptxS1 гена для выявления эпидемических штаммов B.pertussis и создания на их основе перспективных вакцинных препаратов, обладающих высокой протективной активностью в отношении современных циркулирующих штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ дифференциации штаммов B.pertussis по ptxS1 гену, предусматривающий выделение ДНК из штаммов B.pertussis, затем выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров S1-F2 5-CCCCCTGCCATGGTGTGATC-3 и S1-R2 5-AGAGCGTCTTGCGGTCGATC-3 и получением ампликонов фрагмента гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина (ptxS1), которые подвергают последовательно рестрикции эндонуклеазами Ehe I и Bfu I и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле, после чего проводят дифференциацию путем сравнения размера ампликонов фрагментов ДНК ptxS1 гена исследуемых штаммов B.pertussis с контрольными образцами ДНК штаммов B.pertussis, имеющими ptxS1А, ptxS1В, ptxS1D и ptxS1E аллели гена.

При анализе нуклеотидных последовательностей ptxS1 гена штаммов B.pertussis, принадлежащих к ptxS1А аллели, выявлена мутация – замена нуклеотида в положении 684 (гуанин на аденин), которая создает сайт рестрикции для фермента-эндонуклеазы Ehe I, способной расщеплять в данном месте молекулу ДНК. Обнаружение этого факта явилось основанием для использования фермента-эндонуклеазы Ehe I с целью дифференциации штаммов B.pertussis, имеющих ptxS1А аллель гена (тип 1 (EheI)), от штаммов B.pertussis, имеющих ptxS1В, D и Е аллели этого гена (тип 2 (EheI)). При анализе нуклеотидных последовательностей ptxS1 гена штаммов B.pertussis, принадлежащих к ptxS1Е аллели, выявлена мутация – замена нуклеотида в положении 586 (тимин на цитозин), которая создает сайт рестрикции для фермента-эндонуклеазы Bfu I. Это также явилось основанием для использования фермента-эндонуклеазы Bfu I с целью дифференциации штаммов B.pertussis, имеющих ptxS1Е аллель гена (тип I (BfuI)), от штаммов B.pertussis, имеющих ptxS1В и D аллели этого гена (тип II (BfuI)).

Для постановки ПЦР были использованы праймеры S1-F2 5-CCCCCTGCCATGGTGTGATC-3 и S1-R2 5-AGAGCGTCTTGCGGTCGATC-3, которые фланкируют участок ptxS1 гена размером 930 пар оснований (п.о.) Продукты ПЦР были подвергнуты последовательной рестрикции эндонуклеазой Ehe I и Bfu I с последующем электрофоретическим разделением образовавшихся продуктов в агарозном геле и дифференциацией полученных ампликонов путем сравнения размера ампликонов ДНК исследуемого образца с тремя контрольными образцами ДНК штаммов B.pertussis, имеющих ptxS1A, ptxS1B, D и ptxS1E аллели гена. При обработке эндонуклеазой EheI ПЦР-ампликонов, полученных на матрице ptxS1 гена, в электрофорезе определяли два типа рестрикционных профилей с разным набором фрагментов ДНК. Для одной группы штаммов характерным было появление полос в областях 500 п.о., 320 п.о. и 130 п.о., что соответствовало молекулярному весу ампликонов контрольного образца ДНК штамма B.pertussis, имеющему ptxS1A аллель гена. Данный тип рестрикционного профиля обозначен как тип 1 (EheI). Для второй группы штаммов характерным было наличие другого набора фрагментов ДНК – 320 п.о., 300 п.о., 200 п.о. и 130 п.о., что соответствовало молекулярному весу ампликонов контрольного образца ДНК штамма B.pertussis, имеющему ptxS1B, D или Е аллели гена. Данный тип рестрикционного профиля обозначен как тип 2 (EheI). Таким образом, при электрофоретическом разделении продуктов рестрикции можно точно разделить штаммы B.pertussis, имеющие ptxS1А аллель гена (тип 1 (EheI)), от штаммов, имеющих ptxS1В, D и Е аллели этого гена (тип 2 (EheI)). Далее ампликоны последних штаммов B.pertussis были подвергнуты следующей рестрикции с эндонуклеазой Bfu I с последующим электрофоретическим разделением образовавшихся продуктов в агарозном геле. При обработке эндонуклеазой BfuI ПЦР-ампликонов в электрофорезе также определяли два типа рестрикционных профилей с разным набором фрагментов ДНК. Для одной группы штаммов характерным было появление полос в областях 650 п.о., 550 п.о. и 300 п.о., что соответствовало молекулярному весу ампликонов контрольного образца ДНК штамма В.pertussis, имеющему ptxS1E аллель гена. Данный тип рестрикционного профиля обозначен как тип I (BfuI), в то время как для других штаммов характерным было наличие другого набора фрагментов ДНК – 650 п.о., 550 п.о. и 400 п.о., что соответствовало молекулярному весу ампликонов контрольного образца ДНК штамма B.pertussis, имеющему ptxS1B или D аллели гена. Данный тип рестрикционного профиля обозначен как тип II (BfuI). Таким образом, при электрофоретическом разделении продуктов данной рестрикции можно точно разделить штаммы B.pertussis, имеющие ptxS1E аллель гена, от штаммов, имеющих ptxS1В и D аллели этого гена.

Апробация данного способа молекулярно-генетического типирования штаммов B.pertussis была проведена на 234 штаммах B.pertussis различных по серотиповой принадлежности, выделенных в 1948-2004 г.г. Из них 13 штаммов выделены в 1948-59 г.г., 31 штамм – в первые 10 проведения массовой иммунизации (1960-69 г.г.), 42 штамма – в 1970-79 г.г., 32 штамма – в 1980-89 г.г., 31 штамм – в 1990-95 г.г. и 84 штамма выделены в 2002-2004 г.г. В результате проведенного исследования удалось охарактеризовать все изученные штаммы В.pertussis. Оказалось, что для 161 штамма В.pertussis характерным был тип 1 (EheI) рестрикционного профиля и соответственно данные штаммы имели ptxS1А аллель гена, для 72 штаммов B.pertussis характерным был тип 2 (EheI) и тип II (BfuI) рестрикционных профилей и соответственно данные штаммы имели ptxS1В или D аллели гена; для 1 штамма характерным был тип 2 (EheI) и тип I (BfuI) рестрикционных профилей и соответственно данный штамм имел ptxS1E аллель гена.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что применение данного способа дифференцирования штаммов B.pertussis, основанного на использовании феномена эндонуклеазной рестрикции, позволяет различать штаммы B.pertussis, имеющие различную структуру гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина.

Техническим результатом заявленного изобретения является точный, ускоренный, удобный и экономически выгодный способ молекулярно-генетического типирования штаммов B.pertussis, с целью выявления эпидемических штаммов с особенностями генетической структуры ptxS1 гена, что позволит создавать на их основе эффективные вакцинные препараты, обладающие высокой протективной активностью в отношении циркулирующих штаммов B.pertussis вызывающих заболевание коклюшем.

Пример.

Штаммы B.pertussis выращивали на казеиново-угольном агаре, без добавления крови. Через 72 часа, после появления роста изолированных колоний, отбирали 1 колонию, переносили в пробирку с 300 мкл деионизованной воды, выдерживали 15 мин при 95°С, центрифугировали при 13000 оборотов 1 мин, 1 мкл супернатанта добавляли к 49 мкл реакционной смеси. Использовали по 2 мкл каждого из праймеров S1-F2 5-CCCCCTGCCATGGTGTGATC-3 и S1-R2 5-AGAGCGTCTTGCGGTCGATC-3. Условия амплификации – реакционная смесь прогрета при 95°С 3 мин, 30 циклов: 95°С – 15 сек, 59°С – 15 сек, 72°С – 1 мин. Полученные в ПЦР ампликоны подвергали рестрикции эндонуклеазой Ehel в течение 1 часа при 37°С, а затем – электрофорезу в 1,8% агарозном геле при 160 V в течение 1 часа. Гель окрашивали стандартным раствором этидия бромида и результат реакции учитывали с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировали. Определяли тип рестрикционного профиля путем сравнения размера ампликонов ДНК исследуемых образцов штаммов В.pertussis с контрольными образцами ДНК штаммов В.pertussis ptxS1A, ptxS1B, ptxS1D и ptxS1E аллелей гена. Если он соответствовал типу 1 (EheI), то данные штаммы были охарактеризованы как имеющие ptxS1А аллель гена, если как тип 2 (EheI), то данные штаммы рассматривались как имеющие ptxS1В, D или Е аллели. Далее ампликоны, которые после первой рестрикции были отнесены к типу 2 (EheI), подвергали следующей рестрикции эндонуклеазой ВМ в течение 1 часа при 37°С, а затем – электрофорезу в 1,8% агарозном геле при 160 V в течение 1 часа. Учет результатов реакции осуществляли путем определения типов рестрикционных профилей при сравнении с контрольными образцами ДНК штаммов B.pertussis ptxS1B, D и ptxS1E аллелей гена. Так, если он соответствовал типу I (BfuI), то данные штаммы были охарактеризованы как имеющие ptxS1E аллель гена, если как тип II (BfuI), то данные штаммы рассматривались как имеющие ptxS1В или D аллели гена. Результат данного исследования – дифференциация штаммов В.pertussis, имеющих различную структуру гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина.

Литература

1. Семенов Б.Ф., Захарова Н.С., Мазурова И.К. Подъем заболеваемости коклюшем на фоне массовой вакцинации. Гипотезы, объясняющие этот феномен. ЖМЭИ. – 2003. – №6. – стр.70-73.

2. Чистякова Г.Г., Борисова О.Ю., Лыткина И.Н., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Петрова М.С. Особенности эпидемического процесса коклюшной инфекции в Москве на современном этапе. ЖМЭИ. – 2005. – №5

3. Cassiday P.K., Sanden G., Heuvelman К., Popovic Т. Polymorphism in Bordetella pertussis pertactin and pertusis toxin virulence factors in the United States, 1935-1999. – J.Infec.Dis. – 2000. – 182:1402-1408.

8. Mooi F., Hallandef H., Wirsing C.H., Hoet В., Guiso N. Epidemiological typing of Bordetella pertussis isolates: recommehdations for a standard methodology. – Eur.J. Clin. Microbiol. Infect. Diseases. – 2000. – 19:174-181.

Формула изобретения

Способ дифференциации штаммов В. pertussis no ptxS1 гену, предусматривающий выделение ДНК из штаммов В. pertussis, затем выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров S1-F2 5-CCCCCTGCCATGGTGTGATC-3 и S1-R2 5-AGAGCGTCTTGCGGTCGATC-3 с получением ампликонов фрагмента гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина (ptxS1), которые подвергают последовательно рестрикции эндонуклеазами Ehe I и Bfu I и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле, после чего проводят дифференциацию путем сравнения размера ампликонов фрагментов ДНК ptxS1 гена исследуемых штаммов В. pertussis с контрольными образцами ДНК штаммов В. pertussis ptxS1А, ptxS1В, ptxS1D и ptxS1Е аллелей гена.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 27.12.2008

Извещение опубликовано: 10.05.2010 БИ: 13/2010

NF4A – Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.07.2010

Извещение опубликовано: 20.07.2010 БИ: 20/2010