Патент на изобретение №2157992

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИБУНОЛА ИЗ БИООБЪЕКТОВ

(57) Реферат:

Способ может быть использован в области медицины, а именно в судебно-медицинской экспертизе при определении дибунола в тканях и биожидкостях, а также при определении фармакодинамики в различных лекарственных формах. Определяют время экстракции дибунола из биообъектов путем экстракции изопропиловым спиртом в колбе с обратным холодильником на водяной бане с последующим хроматографированием в тонком слое сорбента с использованием системы растворителей хлороформ – ацетон (9:1), проявляют в парах иода, элюируют этиловым спиртом, спектрофотометрируют при длине волны 276 нм. Концентрацию дибунола рассчитывают по формуле С = Д/Е^1%_1см 10/1000, где С – концентрация дибунола в плазме, %, Д – данные оптической плотности; Е^1%_1см – удельный показатель поглощения, равный 101,5. Способ является доступным, более чувствительным, точным, экономичным и простым в исполнении.

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к судебно-медицинской экспертизе при определении дибунола в тканях и биожидкостях, а также при определении фармакодинамики в различных лекарственных формах. Прототипом предлагаемого изобретения является фармакодинамика дибунола в крови и тканях крыс после однократного введения (см. Матвеева С.А. Фармакокинетика нового противоопухолевого препарата – дибунола. Автореф. Дисс. канд. Биол. Наук, Черноголовка, – 1982, – 25 с. По данному способу выделение дибунола из биологических сред осуществляется экстракцией диэтиловым эфиром в реконструированном приборе типа Сокслета. Количественное определение дибунола в образцах определяется на газожидкостном хроматографе “Хром-31” с пламенно-ионизационным детектором при использовании наполнительной колонки с неподвижной фазой Апиезон L в количестве 13 вес.%. На силанизированном хромосорбе W. Температура термостатирования колонки 180^o, объем пробы 1-2 мкл. Чувствительность метода -410^-9 г дибунола, воспроизводимость 10%.

Недостатком данного способа является использование сложной аппаратуры, что является следствием его сложности и низкой воспроизводимости и чувствительности.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение способа и повышение его воспроизводимости, а также чувствительности. Данная цель достигается тем, что зкстракция при определении дибунола из биообъектов осуществляется изопропиловым спиртом в колбе с обратным холодильником на водяной бане с последующим хроматографированием в тонком слое сорбента с использованием системы растворителей хлороформ – ацетон (9:1) и спектрофотометрическим определением.

Способ определения дибунола из тканей осуществляют следующим образом. Биообъект помещают в сухую химическую колбу емкостью 100 см³ в количестве 1 мл и прибавляют 50 мл изопропилового спирта, перемешивают стекляной палочкой и ставят на водяную баню. Колбу закрывают обратным холодильником и проводят экстракцию при 80^oC в течение экспериментально установленного времени для каждого биологического объекта следующим образом. Способ определения времени экстракции дибунола из биообъектов осуществляют следующим образом. В сухую химическую колбу емкостью 100 см³ помещают 3 мл гомогената биообъекта (1,0 г исследуемого органа и 3 мл физиологического раствора), прибавляют 50 мл изопропилового спирта, перемешивают стеклянной палочкой и ставят на водяную баню. Колбу закрывают обратным холодильником и проводят экстракцию дибунола из каждого биологического объекта при 80^oC в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 часов.

После каждого часа экстракции вытяжку в изопропиловом спирте охлаждают при комнатной температуре и обезвоживают 5,0 г сульфата меди (предварительно прокаленным). Обезвоженный раствор фильтруют через бумажный фильтр “синяя лента”, в сухой химический стакан емкостью 50 см³ и фотометрируют на спектрофотометре марки HEWLETT PACKARD 8452А при длине волны 276 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. На основании полученных данных время экстракции дибунола из биообъектов определяют по максимальному значению интенсивности оптической плотности. Время экстракции дибунола из биологических объектов: в плазме соответствует 5 часам; в печени – 4 часам; в почках – 3 часам; в сердце – 2 часам; в мозговой ткани – 4 часам; в подкожной жировой клетчатке – 3 часам.

Экстракт охлаждают при комнатной температуре и обезвоживают 5 г меди сульфата (предварительно прокаленным). Экстракт фильтруют через бумажный фильтр “синяя лента” в сухой химический стакан емкостью 50 см³, в сухую выпарительную чашку емкостью 25 см³ помещают 5 мл фильтрата и выпаривают на водяной бане до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл этилового спирта 96%. Проводят хроматографическое определение в тонком слое сорбента, которое осуществляется следующим образом. Стеклянным капилляром наносят исследуемый раствор на линию старта хроматографической пластинки марки “Сорбфил” и параллельно наносят “свидетель” – 0,5% раствор дибунола в этиловом спирте. Пластинку хроматографируют в системе растворителей хлороформ – ацетон (9:1), пробег фронта растворителей 10 см. После подсушивания на воздухе пластинку рассматривают в ультрафиолетовом (УФ) свете, на участках с исследуемым раствором наблюдают флюоресцирующие пятна. Пластинку проявляют в парах йода, на участке с исследуемым раствором наблюдают окрашенные пятна желтого цвета с R_f = 0,9. На проявленных пластинках отмечают пятна и элюируют. Элюат помещают в сухой химический стакан емкостью 25 см³ и растворяют в 5 мл этилового спирта 96%, фильтруют через бумажный фильтр и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре марки HEWLETT PACKARD 8452А при длине волны 276 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служит опыт интактных животных, который подготовлен к анализу аналогичным образом.

На основании полученных данных оптической плотности вычисляют концентрацию дибунола в биообъектах по формуле:
C = D/E^1%_{1 см} 10/1000, где
C – концентрация дибунола в биообъекте (%);
D – данные оптической плотности;
E^1%_{1 см} – удельный показатель поглощения, равный 101,5.

Чувствительность -0,8910^-9 г дибунола, воспроизводимость 4,16%.

Пример 1. Способ определения дибунола из биообъекта (плазмы) осуществляют следующим образом. Биообъект – плазму помещают в сухую химическую колбу емкостью 100 см³ в количестве 1 мл, и прибавляют 50 мл изопропилового спирта, перемешивают стеклянной палочкой, и ставят на водяную баню. Колбу закрывают обратным холодильником и проводят экстракцию при 80^oC, в течение 5 часов – экспериментально установленного времени. Экстракт охлаждают при комнатной температуре и обезвоживают 5,0 меди сульфата (предварительно прокаленным). Экстракт фильтруют через бумажный фильтр “синяя лента” в сухой химический стакан емкостью 50 см³ в сухую выпарительную чашку емкостью 25 см³ помещают 5 мл фильтрата и выпаривают на водяной бане до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл этилового спирта 96% и стеклянным капилляром наносят на линию старта хроматографической пластинки марки “Сорбфил”. Параллельно наносят “свидетель” – 0,5% раствор дибунола в этиловом спирте. Пластинку хроматографируют в системе растворителей хлороформ – ацетон (9:1), пробег фронта растворителей 10 см. После подсушивания на воздухе пластинку рассматривают в УФ – свете, на участках с исследуемым раствором наблюдают флюоресцирующие пятна. Пластинку проявляют в парах йода, на участке с исследуемым раствором наблюдают окрашенные пятна желтого цвета с R_f = 0,9. На проявленных пластинках отмечают пятна простым карандашом и элюируют. Элюат помещают в сухой химический стакан емкостью 25 см³ и растворяют в 5 мл этилового спирта 96%, фильтруют через бумажный фильтр и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре марки HEWLETT PACKARD 8452А при длине волны 276 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служит интактный опыт, который подготовлен к анализу аналогичным образом:
На основании полученных данных оптической плотности вычисляют концентрацию дибунола в плазме по формуле
C = D/E_{1 см}^1% 10/1000, где
C – концентрация дибунола в плазме (%),
D – данные оптической плотности;
E_{1 см}^1% – удельный показатель поглощения, равный 101,5.

Пример 2. Способ определения дибунола из биообъекта (сердца) проводят по методике примера 1. Экстракцию дибунола из тканей сердца проводят в течение экспериментально установленного времени – 2 часа, что соответствует его максимальному содержанию в данном биообъекте.

Пример 3. Способ определения дибунола из биообъекта (мозговой ткани) проводится по методике примера 1. Экстракцию дибунола из мозговой ткани проводят в течение экспериментально установленного времени – 4 часа, что соответствует его максимальному содержанию в данном биообъекте.

Пример 4. Способ определения дибунола из биообъекта (печени) проводят по методике примера 1. Экстракцию дибунола из тканей печени проводят в течение экспериментально установленного времени – 4 часа, что соответствует его максимальному содержанию в данном биообьекте.

Пример 5. Способ определения дибунола из биообъекта (почек) проводят по методике примера 1. Экстракцию дибунола из тканей почек проводят в течение экспериментально установленного времени – 3 часа, что соответствует его максимальному содержанию в данном биообъекте.

Пример 6. Способ определения дибунола из биообъекта (подкожной жировой клетчатки) проводят по методике примера 1. Экстракцию дибунола из тканей подкожной жировой клетчатки проводят в течение эспериментально установленного времени – 3 часа, что соответствует его максимальному содержанию в данном биообъекте.

Данное изобретение было апробировано на белых беспородных крысах-самцах для определения дибунола в тканях и биожидкостях. Концентрация дибунола определялась в биообъектах на животных со спровоцированными заболеваниями и в сравнении с контрольной группой. Опытным животным дибунол вводился перорально в виде таблеток из расчета 50 мг/кг, и был обнаружен в максимальном количестве в плазме к 2 часу после введения 3,4810^-6 мкг и ректально в виде суппозиториев из расчета 50 мг/кг, и был обнаружен в максимальном количестве в плазме к 1 часу после введения 4,1410^-6 мкг. Дибунол был обнаружен для последующего определения распределения его в органах при различных путях введения, что имеет исключительно важное значение при судебно-медицинской экспертизе и изучения методов лечения различных заболеваний, их коррекции, титрования дозы – гастродуоденальных язв, гепатитов, колитов, профилактики сердечно-сосудистых заболеваний и применения в дерматологической практике.

Предложенный метод по сравнению с прототипом является доступным, более чувствительным -0,8910^-9 г дибунола, воспроизводимым 4,16%, точным, экономичным, простым в исполнении в связи с использованием несложного оборудования (колбы с обратным холодильником, водяной бани, хроматографической камеры, хроматографических пластинок марки “Сорбфил” и спектрофотометра), доступных и недорогих реактивов (спирт этиловый, спирт изопропиловый, хлороформ ацетон, сульфат меди).

Формула изобретения

Способ определения дибунола из биообъектов, включающий экстракцию, хроматографирование, отличающийся тем, что определяют время максимальной экстракции дибунола из биообъекта путем экстракции в изопропиловом спирте и спектрофотометрирования, вытяжку, полученную при максимальном времени экстракции, обезвоживают, фильтруют, выпаривают, растворяют в этиловом спирте и хроматографируют в тонком слое сорбента с использованием системы растворителей хлороформ – ацетон (9 : 1), проявляют в парах йода, элюируют этиловым спиртом, измеряют оптическую плотность при длине волны 276 нм и концентрацию дибунола рассчитывают по формуле
С = D/E_1см^1% 10/1000,
где С – концентрация дибунола в биообъекте, %;
D – данные оптической плотности;
E_1см^1% – удельный показатель поглощения, равный 101,5.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 23.02.2001

Номер и год публикации бюллетеня: 35-2002

Извещение опубликовано: 20.12.2002