Патент на изобретение №2298793

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И РАЗДЕЛЕНИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и предназначено для определения состава жирных кислот (ЖК) в биологических тканях организма. Способ включает обработку крови хлороформметанольной смесью в соотношении 2:1, гидролиз и метилирование липидов в растворе серной кислоты и метанола при 80°С в течение 3 часов, охлаждение, обработку метилированной пробы гексансодержащим раствором, высушивание в токе азота и проведение газохроматографического определения и разделения жирных кислот на полярной жидкой фазе диэтиленгликольсукцината (ДЭГС), нанесенного на колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м при температуре термостата колонки 140°С. Колонку перед нанесением на нее ДЭГС многократно промывают хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, ДЭГС наносят на внутреннюю стенку капиллярной колонки динамическим методом так, что толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм, затем проводят продувку колонки азотом 5-6 часов на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С. Способ позволяет повысить чувствительность определения и разделения ЖК в биологических тканях организма в среднем в 34,95 раз. 2 ил., 3 табл.

Изобретение относится к медицине и предназначено для определения состава жирных кислот (ЖК) в биологических тканях организма.

Известен способ оценки спектра ЖК (патент РФ №2237245, G 01 N 33/48, бюл. №27, 27.09.2004 г.), включающий экстрагирование липидов хлороформ-метанольной смесью, гидролиз и метилирование липидов во влажной камере в течение 6 часов с разделением ЖК с помощью полярной жидкой фазы 20% диэтиленгликольсукцината (ДЭГС) на хроматоне N-AW-DMCS при температуре термостата стеклянной колонки 180°С. Однако этот способ имеет недостаточную чувствительность регистрации жирных кислот при их низком содержании в тканях организма.

Задача изобретения: повышение чувствительности определения и разделения ЖК.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что используют капиллярную колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м, перед нанесением ДЭГС на внутреннюю стенку капиллярной трубки последнюю многократно промывают органическими растворителями: хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, для лучшего закрепления пленки ДЭГС, после промывки используют динамический метод нанесения ДЭГС: жидкую фазу ДЭГС прокачивают через капиллярную трубку с помощью сухого азота, растворитель испаряют и удаляют при продувке колонки азотом, толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм, после этого проводят продувку колонки азотом в течение 5-6 часов на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С, гидролиз и метилирование проводят в течение 3 часов с разделением жирных кислот на полярной жидкой фазе диэтиленгликольсукцината, нанесенного на капиллярную колонку, при температуре колонки термостата 140°С.

Способ осуществляют следующим образом.

Приготовление капиллярной колонки с полярной жидкой фазой диэтиленгликольсукцинат (ДЭГС): используют капиллярную колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м. Перед нанесением ДЭГС на внутреннюю стенку капиллярной трубки последнюю многократно промывают органическими растворителями: хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, для лучшего закрепления пленки ДЭГС. После промывки используют динамический метод нанесения ДЭГС. При этом жидкую фазу ДЭГС прокачивают через капиллярную трубку с помощью сухого азота. Затем растворитель испаряют и удаляют при продувке колонки азотом, толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм. После этого проводят продувку азотом в течение 5-6 часов на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С.

Для анализа метиловых эфиров жирных кислот общих липидов плазмы крови используют газовый хроматограф «Кристалл 2000 М». Для этого в образец добавляют 0,05 мл гексана, из полученного объема в инжектор хроматографа вносят 1 мкл пробы. Использовали режимы термостата колонки 140, 180 и 200°С. Идентификацию жирных кислот проводят с использованием стандартной смеси жирных кислот в концентрации 1 мкг/мл гексана по времени удерживания каждой жирной кислоты (производство стандартов метиловых эфиров жирных кислот фирмы «Serva», Германия).

В таблице 1 показана зависимость уровня регистрации ЖК от температуры колонки.

Примечание:

Как показывают результаты таблицы 1, температура 140°С термостата колонки наиболее оптимальна по сравнению с 200°С и 180°С для разделения и регистрации ЖК. Общий уровень при температуре 140°С, по сравнению с другими температурными режимами, в 2,2-2,5 раз соответственно выше (Табл.1, общая площадь)

На фиг.1. отображена хроматограмма ЖК на стеклянной колонке с диэтиленгликольсукцинатом на хроматоне N-AW-DMCS. При разделении и регистрации ЖК в количестве, эквивалентном их содержанию в 10 мкл плазмы или при разведении в 100 раз, показана идентификация 5 жирных кислот: лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, олеиновой и линолевой. Совсем не идентифицируются при данном разведении эйкозеновая, эйкозотриеновая, арахидоновая, эйкозопентаеновая и докозогексаеновая ЖК.

На фиг.2. отображена хроматограмма ЖК на капиллярной колонке с диэтиленгликольсукцинатом. При определении той же концентрации ЖК показана идентификация 10 жирных кислот: лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, пальмитолеиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой, арахидоновой, эйкозопентаеновой и докозогексаеновой. То есть по предлагаемому способу при данном разведении идентифицируется в 2 раза больше ЖК.

В таблице 2 представлена сравнительная характеристика определения эквивалентных количеств жирных кислот в прототипе и предлагаемом способах, выраженная в площади каждого пика (мм²). Из таблицы видно, что количественный уровень регистрации ЖК, в сравнении с прототипом, возрос от 5,33 до 615,22 раз. В целом чувствительность предлагаемого нами способа возрастает в среднем в 34,95 раза.

В таблице 3 показана возможность определения спектра ЖК предлагаемым способом в других тканях организма: эритроцитах, тромбоцитах.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность определения и разделения ЖК в биологических тканях организма в среднем в 34,95 раз.

Формула изобретения

Способ определения и разделения жирных кислот в биологических тканях крови организма, включающий обработку крови хлороформметанольной смесью в соотношении 2:1, гидролиз и метилирование липидов в растворе серной кислоты и метанола при 80°С, охлаждение, обработку метилированной пробы гексансодержащим раствором, высушивание в токе азота и проведение газохроматографического определения и разделения жирных кислот на полярной жидкой фазе диэтиленгликольсукцината (ДЭГС), нанесенного на колонку, отличающийся тем, что гидролиз и метилирование липидов проводят в течение 3 ч, для газохроматографического определения и разделения жирных кислот используют капиллярную колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м, которую перед нанесением на нее ДЭГС многократно промывают органическими растворителями хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, ДЭГС наносят на внутреннюю стенку капиллярной колонки динамическим методом, при котором жидкую фазу ДЭГС прокачивают через капиллярную колонку с помощью сухого азота, растворитель испаряют и удаляют при продувке колонки азотом, где толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм, затем проводят продувку колонки азотом 5-6 ч на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С, а газохроматографическое определение и разделение жирных кислот осуществляют при температуре термостата колонки 140°С.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 25.11.2007

Извещение опубликовано: 10.05.2009 БИ: 13/2009