Патент на изобретение №2298560
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) КОНЪЮГАТЫ БЕЛКА И ПРОИЗВОДНОГО ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ БОРЬБЫ С ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к новым физиологически активным конъюгатам белка, которые могут быть использованы в медицине. Предложенный конъюгат образован молекулой белка и полиэтиленгликоля и имеет следующую формулу:
Изобретение относится к новым ПЭГ-производным белков, в частности к ПЭГ-производным интерферона, которые могут быть использованы в медицине, например при лечении вирусных заболеваний. Лечение нативными препаратами пептидной структуры имеет ряд существенных недостатков: белки быстро гидролизуются в гастроинтестинальном отделе пищеварительного тракта и поэтому используются, как правило, парентерально. Относительно короткий период полураспада таких препаратов в организме пациента препятствует достижению их максимального терапевтического воздействия и предусматривает их многократное использование. Еще одним важным негативным фактором, ограничивающим применение нативных или рекомбинантных белковых препаратов, является их высокая иммуногенность и связанные с ней сенситивные реакции. Принципиальное изменение структуры их молекулы либо нивелирует их биологические свойства, либо влечет за собой увеличение побочных эффектов, связанных с их применением. Одним из путей повышения эффективности лекарственных препаратов белковой структуры является химическая модификация их молекулы, состоящая не в собственно изменении их структуры, а в физико-химической трансформации, достигаемой соединением нативной молекулы с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Данный процесс получил название «пегилирование». Подобная химическая модификация фармакологических препаратов пептидной структуры направлена на улучшение их переносимости, снижение иммуногенности, повышение периода их полужизни, и как следствие всего перечисленного, на значительное увеличение эффективности лечения и повышение качества жизни в процессе его проведения. ПЭГ в качестве потенциального объекта – модификатора веществ пептидной структуры привлек внимание исследователей еще в начале 1970х годов. Молекулы ПЭГ – это водорастворимые полимеры окиси этилена с двумя терминальными гидроксильными группами. Молекулярный вес молекул ПЭГ может колебаться в пределах 300-4000 Дальтон, а выстроенные в цепи макромолекулы ПЭГ могут формировать как разветвленную, так и линейную стереохимию. Именно масса ПЭГ и его стереохимическая структура, как правило, определяют свойства модифицированного пептидного субстрата. Гидрофильность модифицированных ПЭГ-молекул формирует принципиально новые физико-химические свойства измененного пептида. Высокое содержание атомов водорода даже в одной молекуле ПЭГ позволяет ей связываться с 2-3 молекулами воды. Подобный эффект влечет за собой формирование «водного облака» вокруг модифицированной молекулы «ПЭГ-белок». Этот своеобразный «щит» воды вокруг модифицированной молекулы с одной стороны значительно повышает растворимость и биодоступность препарата, с другой – защищает молекулу от других белков (нейтрализующие антитела, комплемент). Таким образом ПЭГ-модифицированные пептиды значительно более защищены от опсонизации и активного фаго- и эндоцитоза клеточных структур макроорганизма. Изменения фармакокинетических и фармакодинамических свойств ПЭГ-модифицированных пептидов зависят от массы молекулы ПЭГ, специфических мест связи с белком, строения молекулы модифицирующего агента. Интерфероны – это группа биологически активных белков или гликопротеидов, синтезируемых клеткой в процессе защитной реакции на чужеродные агенты – вирусную инфекцию, антигенное или митогенное воздействие. ИФН не обладают специфичностью в отношении вирусов и действуют угнетающе на репродукцию различных вирусов. Важны также другие эффекты ИФН, интерес к ним обусловлен высокой эффективностью применения препаратов интерферона при таких патологических состояниях, как и онкологические заболевания, болезни крови, а также неуклонным ростом числа больных, страдающих вышеперечисленными заболеваниями. Пегилированный интерферон представляет собой конъюгат молекулы интерферона и ковалентно прикрепленного к ней участка молекулы полиэтиленгликоля, который защищает молекулу интерферона от ферментного разрушения и обеспечивает препарату ряд других преимуществ. Известны, в частности, пэгилированные производные интерферона, полученные присоединением молекулы разветвленного полиэтиленгликоля к интерферону Задачей, на решение которой направлено изобретение, является создание новых конъюгированных производных интерферона, обладающих повышенной стабильностью по сравнению с известными аналогами. Для решения поставленной задачи в рамках настоящего изобретения были синтезированы новые ПЭГ-производные интерферона. В ходе проведенных экспериментов было неожиданно обнаружено, что эти пэгилированные производные обладают значительно более длительным сроком персистирования в организме, чем известные. Данное свойство этих соединений позволит поддерживать постоянную эффективную концентрацию препаратов на их основе в крови при меньшей кратности введения, что позволит повысить эффективность проводимой терапии и снизит затраты на лечение. ПЭГ-производные белков согласно настоящему изобретению представляют собой конъюгат белка и производного полиэтиленгликоля формулы
где белок представляет собой интерферон График (см. чертеж) отражает уровень биологически активного интерферона в сыворотке крови в условных единицах активности. Из графика видно, что заявленные соединения обладают значительно более высокой стабильностью по сравнению с другими производными – в течение 14 дней наблюдения его выведение из организма не отмечалось. На графике использованы следующие обозначения: Соединение 1 – конъюгат по изобретению, Соединение 2 – конъюгат 2,4-бис-(метоксиполиэтилен)триазина и интерферона Соединение 3 – конъюгат 2,4-бис-(метоксиполиэтилен)триазина и интерферона Соединение 4 – конъюгат 2,4-бис-(метоксиполиэтилен)триазина и интерферона Соединение 5 – конъюгат 2,4-бис-(метоксиполиэтилен)триазина и интерферона Известный аналог – конъюгат полиэтиленгликоля и интерферона Пример 1. Получение ПЭГ-производных Вначале получают полиэтиленоксид многостадийным или одностадийным синтезом. В качестве стартового вещества использовали олигоэтиленоксид с молекулярной массой 250 (средняя степень полимеризации 4,5), полученный при взаимодействии окиси этилена с метилатом натрия. При одностадийном синтезе к 100 г стартового вещества постепенно в течение 12 дней при повышении температуры от 120 до 170°С под давлением 4-5 атм добавляли 2500 г окиси этилена. Многостадийный синтез проводят следующим образом: 1 стадия. К 100 г стартового вещества добавляют 700 г окиси этилена. Реакцию проводят в стальном реакторе с мешалкой в атмосфере азота под давлением 4 атм при температуре 120°С в течение 8 часов. 2 стадия. К 100 г продукта, полученного на стадии 1, добавляют 700 г окиси этилена. Реакцию проводят в тех же условиях в течение 9 часов. 3 стадия. К 170 г продукта, полученного на стадии 2, добавляют 330 г окиси этилена. Реакцию проводят при температуре 140°С в течение 9 часов. 4 стадия. К 200 г продукта, полученного на стадии 3, добавляют 330 г окиси этилена. Реакцию проводят при температуре 140°С в течение 9 часов. 5 стадия. К 400 г продукта, полученного на стадии 4, добавляют 120 г окиси этилена. Реакцию проводят при температуре 160°С в течение 9 часов. 6 стадия. К 210 г продукта, полученного на стадии 5, добавляют 340 г окиси этилена. Реакцию проводят при температуре 170°С в течение 9 часов.
Синтез полиэтиленоксидов, разветвленных с помощью цианурхлорида осуществляют в одну стадию в растворе 1,2-дихлорэтана путем взаимодействия очищенного методом возгонки цианурхлорида с NaO-полиэтиленоксидом с различной длиной цепи. При этом проводят взаимодействие между 15% раствором полиэтиленоксида с цианурхлоридом в присутствии триэтиламина (25% моль от общего количества концевых групп)
Реакцию проводят при 80°С в течение часа. Полученный полимер высаживают в 4-х кратный избыток серного эфира, а затем трехкратно промывают им же. Таким образом получают триазиновые производные полиэтиленоксида формулы:
Пример 2. ПЭГилирование интерферона- Возможность использования этих соединений для модификации белков продемонстрирована на примере интерферона. Интерферон- Пример 3. Антивирусная активность конъюгатов интерферона- Отбирают пробы по 2 мл следующей расчетной активности: 1) стандарт (исходный интерферон) – 25 мкг/мл (3.5×106) 2) конъюгат по изобретению – 24 мкг/мл (3.36×106) Противовирусную активность проверяют стандартным методом в культуре клеток легких человека Л-68 против вирусного везикулярного стоматита. Биологическое тестирование дало следующие результаты:
Биоактивность приведенная – биоактивность определенная, умноженная на коэффициент, получаемый от деления расчетной активности стандарта на определенную активности стандарта. Приведенную биоактивность рассчитывают для определения уменьшения удельной активности интерферона в процессе модификации. Таким образом, модифицированный интерферон- Пример 4. Исследование фармакокинетики препаратов Беспородным крысам внутривенно вводили следующие препараты: Конъюгат по изобретению по 0,56 мл=13,5 мкг/крыса. Известный аналог – пэгилированное производное интерферона (согласно RU 2180595) – по 0,1 мл=13,5 мкг/крыса У каждой крысы через 1 час после введения из хвостовой вены брали по 0,5 мл крови. Для этого скальпелем отсекали 1,5-2 мм плоти хвоста. Кровь собирали в пробирки типа Eppendorf. Пробирки помещали в термостат и инкубировали 30 минут при 37°С. Стеклянным капилляром отделяли образовавшийся тромб от стенок пробирки. Пробирки помещали в холодильную камеру и инкубировали 4-6 часов при +4°С. Автоматической пипеткой отсасывали сыворотку и для удаления клеток крови центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут. Для стерилизации образцов сыворотки крови супернатанты переносили в системы фильтрации Ultrafree-MC (Amicon) и центифугировали при 2000 об/мин в течение 10 минут. Образцы для тестирования хранили при +4°С. Результаты измерения уровня биологически активного интерферона за период 14 дней показаны на графике. Пример 5. Токсичность полученных ПЭГ-производных Эксперименты по изучению острой токсичности выполнялись на белых нелинейных мышах и крысах. Для исследования каждой дозы препарата использовались группы по 6 животных. При использовании интервала доз от 1 до 15 МЕ/кг летальных эффектов не наблюдалось. Учитывая то, что максимальная терапевтическая доза для человека составит около 0,03 МЕ/кг, препараты являются малотоксичными. Пример 6. Противовирусная активность in vivo Для определения противовирусной активности 20 мышам весом 10-12 г вводят 0,2 мл препарата 24 мкг/мл внутрибрюшинно за 24 и 2 ч до заражения смертельным вирусом. Животных наблюдают в течение 14 дней. Если процент выживаемости составляет более 60%, то тестируемый препарат считается активным. Для конъюгата по изобретению этот показатель составил 90%, что позволяет отнести его к высокоактивным.
Формула изобретения
1. Конъюгаты белка и производного полиэтиленгликоля формулы
где белок представляет собой интерферон 2. Конъюгаты по п.1, где n=n1=120, а молекулярная масса звеньев полиэтиленгликоля составляет приблизительно 10000 Да. 3. Фармацевтическая композиция, обладающая противовирусной активностью, содержащая коньюгат по любому из пп.1 и 2 и терапевтически инертный носитель. 4. Способ борьбы с вирусной инфекцией, включающий введение в организм конъюгата по любому из пп.1 и 2 в эффективном количестве.
РИСУНКИ
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Извещение опубликовано: 10.06.2008 БИ: 16/2008
|
||||||||||||||||||||||||||
-2b, a n и n1 имеют такие значения, что средняя молекулярная масса звеньев полиэтиленгликоля составляет от приблизительно 7500 Да до приблизительно 35000 Да. Конъюгат обладает повышенной стабильностью по сравнению с известными аналогами. Изобретение также относится к фармацевтической композиции с противовирусной активностью, содержащей указанный коньюгат, и к способу борьбы с вирусной инфекцией. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил.
-1,
