Патент на изобретение №2297290

(54) СПОСОБ РЕКУЛЬТИВАЦИИ ОТБЕЛИВАЮЩЕЙ ЗЕМЛИ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ НЕФТЕПРОДУКТАМИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к очистке отбеливающей земли от загрязнения нефтепродуктами. Способ включает внесение в почву биомассы консорциума нефтеокисляющих штаммов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 и биомассы штамма бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 при массовом соотношении биомасс, равном 1:1. Изобретение позволяет активировать процесс биодеградации нефтепродуктов, причем степень деградации за 5 месяцев составляет 81%. 5 табл.

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к охране почвенных ресурсов от загрязнения нефтепродуктами.

В настоящее время предприятия нефтеперерабатывающего комплекса, использующие для контактной доочистки базовых масел (удаления смолистых соединений и полициклических ароматических углеводородов) отбеливающую землю, вынуждены отходы своего производства складировать в виде отвалов, тем самым усугубляя экологическую обстановку и занимая дополнительно отчуждаемые территории.

Известны различные биологические способы рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, основанные на интродукции в такие почвы специализированных микроорганизмов, предварительно выделенных из различных загрязненных источников или генетически модифицированных. Основными агентами биодеструкции нефти и нефтепродуктов являются бактерии. Объясняется это тем, что использование углеводородов в своей жизнедеятельности среди бактерий распространено достаточно широко.

Ряд исследователей показали, что бактерии рода Rhodococcus являются перспективными для создания на их основе препаратов по биодеструкции нефти и нефтепродуктов, загрязняющих почву [1, 2].

Спорообразующие бактерии также широко используются для создания препаратов, способствующих очищению почвы и воды от контаминации нефтью [3-5].

Недостатками этих препаратов является низкая эффективность по рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, основную часть которых составляют смолистые вещества и полициклические ароматические соединения.

Наиболее близким к предлагаемому является способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, где для активизации процесса биодеструкции нефтепродуктов используют биомассу консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 [6].

Недостатком известного способа является сравнительно низкая степень биодеструкции нефтепродуктов.

Технической задачей предлагаемого способа является повышение эффективности биодеградации нефтепродуктов, содержащихся в отбеливающей земле.

Поставленная задача решается путем внесения в отбеливающую землю добавки, содержащей кроме биомассы консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 биомассу аэробных азотфиксирующих микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4, вносимой в массовом соотношении 1:1 к консорциуму нефтеокисляющих микроорганизмов.

Указанный штамм микроорганизмов Azotobacter vinelandii известен в качестве основы биопрепарата для борьбы с корневыми гнилями пшеницы и повышения количества и качества урожая [7].

Примеры конкретного выполнения.

В лабораторных испытаниях способа биологической рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, использовали отбеливающую землю, отобранную с отвалов ОАО «Орскнефтеоргсинтез», биомассу консорциума микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species, полученную при их совместной ферментации, и биомассу микроорганизмов Azotobacter vinelandii.

Консорциум микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 (биопрепарат «Ленойл») выращивают в аэробных условиях на питательной среде следующего состава, г/л: Na₂СО₃ – 0,1; CaCl₂ – 0,01; MnSO₄·7H₂O – 0,02; FeSO₄·7H₂O – 0,02; NaH₂PO₄ – 1,5; К₂HPO₄ – 1,0; MgSO₄·7H₂O – 0,2; NH₄NO₃ – 2,0; вода дистиллированная до 1000 мл. В качестве единственного источника углерода используется дизельное топливо, процесс ферментации проводят при комнатной температуре до достижения титра микроорганизмов в культуральной жидкости, равного 10⁹ КОЕ/мл.

Биомассу микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4 (биопрепарат «Азолен») выращивают в аэробных условиях на питательной среде следующего состава, г/л: KH₂PO₄ – 0,2; К₂HPO₄ – 0,8; CaSO₄·2H₂O – 0,1; MgSO₄·7H₂O – 0,2; FeCl₃ – 0,01; Na₂MoO₄ – 0,01; дрожжевой экстракт – 0,5; сахароза – 20 г; вода дистиллированная до 1000 мл. Процесс ферментации проводят при комнатной температуре до достижения титра микроорганизмов в культуральной жидкости, равного 10⁹ КОЕ/мл.

Для оценки интенсивности разложения нефтепродуктов использовали показатель остаточного содержания нефтепродуктов в отбеливающей земле.

Определение остаточного содержания нефтепродуктов проводили спектрофотометрическим и весовым методами [8]. По первому из них пробу весом 10 г помещали в патрон из фильтровальной бумаги и переносили в аппарат Сокслета. Экстракцию проводили 120-150 мл гексана в течение 2-3 часов при температуре кипения гексана (69°С). Концентрацию углеводородов в пробе определяли по оптической плотности экстракта на спектрофотометре СФ-46 при длине волны, на которой данная смесь углеводородов имела максимальный пик поглощения. Максимальный пик поглощения определяли на спектрофотометре SPECORD UF-VIS. По весовому методу пробу весом 10 г помещали в патрон из фильтровальной бумаги и взвешивали на электронных весах. Проэкстрагированные пробы вместе с патронами высушивали в жарочном шкафу при температуре 100-120°С и снова взвешивали на электронных весах. По разнице в весе проб до и после экстракции определяли содержание остаточных нефтепродуктов.

Численность основных групп микроорганизмов, участвующих в биотрансформации нефтепродуктов, определяли посевом почвенной суспензии методом разведений на плотные питательные среды [9]: бактерий, усваивающих органический азот – на мясопептонном агаре (МПА), олигонитрофилов – на питательной среде Эшби, микроскопических грибов (микромицетов) – на среде Чапека и углеводородокисляющих микроорганизмов – на среде Цукамуры, где в качестве источника углерода была использована стерильная смесь углеводородов, полученная после экстракции гексаном загрязненной отбеливающей земли.

Повторность опытов – трехкратная.

Схема лабораторного (модельного) опыта по рекультивации отбеливающей земли: в отбеливающую землю, содержащую 181 г/кг остаточных углеводородов, вносили минеральные удобрения (нитрофоска из расчета 0,25 г/кг субстрата), биопрепарат «Ленойл» из расчета к отбеливающей земле и биопрепарат «Азолен» в массовом соотношении к биопрепарату «Ленойл», составляющем 1:1, 1,25:1 и 0,75:1. Повторность опытов – трехкратная, длительность экспериментов – 150 сут. Влажность в сосудах в течение всего срока инкубации поддерживали на уровне 60%, температуру – 20-25°С. Отбор проб отбеливающей земли осуществляли через 30 суток.

Результаты испытания предлагаемого способа рекультивации отбеливающей земли показали, что внесение консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species с дополнительной добавкой биомассы бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 значительно повышает эффективность процесса биодеградации нефтепродуктов в отбеливающей земле (табл.1). Через 150 суток инкубации степень снижения содержания нефтепродуктов по предлагаемому способу составила 81,3 мас.%. Применение биопрепарата «Ленойл» без внесения биопрепарата «Азолен» в условиях опыта оказалось менее эффективным по сравнению с предложенным техническим решением, а степень биодеградации нефтепродуктов составила всего 69,3 мас.%. При массовом соотношении биомассы бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 к биомассе консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов, составляющим 0,75:1, эффективность процесса биодеградации нефтепродуктов снижалась, а при соотношении 1,25:1 величина степени биодеградации практически не отличалась от соответствующего показателя, достигнутого при массовом соотношении, равном 1:1.

Внесение биомассы бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 способствует значительному увеличению численности почвенных микроорганизмов, принимающих участие в трансформации нефтепродуктов, загрязняющих отбеливающую землю – гетеротрофных бактерий, растущих на МПА, олигонитрофилов, углеводородокисляющих бактерий и микромицетов (табл.2-5). В процессе своей жизнедеятельности бактерии Azotobacter vinelandii ИБ 4 секретируют в окружающую среду различные биологически активные вещества, в том числе цитокинины [7], и, по-видимому, биомасса этих микроорганизмов играет роль эффективного биологического удобрения, стимулирующего развитие всей микробиоты в нефтезагрязненном объекте.

Таким образом, предлагаемый способ биологической рекультивации отбеливающей земли с применением консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 и дополнительным внесением биомассы бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 по сравнению с известным позволяет повысить эффективность процесса биоразложения нефтепродуктов в почве, активизировать микробиологическую активность почвы.

Список литературы

1. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов: А.с. 1805097 СССР, МКИ⁵

2. Способ очистки почв от нефтяных загрязнений: Пат. 2019527, Россия, МКИ⁵

3. Штамм бактерий Bacillus sp. – деструктор нефтепродуктов и фенолсодержащих соединений: Пат. 1784592, СССР, МКИ⁵

5. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами: Пат. 2077397, Россия, МКИ⁶

6. Способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами: Пат. 2237711, Россия, МКИ⁷

7. Штамм бактерий Azotobacter vinelandii для получения биопрепарата для борьбы с корневыми гнилями пшеницы и повышения количества и качества урожая: Пат. 2245918, Россия, МКИ⁷

9. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. – М.: МГУ. – 1980. – 223 с.

Формула изобретения

Способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, путем внесения в почву добавки, содержащей биомассу консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3, отличающийся тем, что указанная добавка дополнительно содержит биомассу микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4, вносимой в массовом соотношении, равном 1:1 к консорциуму нефтеокисляющих микроорганизмов.