Патент на изобретение №2295974

(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИБРИОЗА РЫБ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и рыбоводству. Предложен способ изготовления эритроцитарного антигена для диагностики вибриоза рыб. Способ предусматривает приготовление питательных сред, посевного материала и получение сенситина из штаммов Vibrio anguillarum №2 и VUR-19, с последующей сенсибилизацией эритроцитов барана. При этом используют 20% взвесь формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе с pH 7,0-7,4. Сенсибилизацию проводят на водяной бане в два этапа. Эритроциты и сенситин берут в соотношении 1:0,3-1:0,35. Изобретение может быть использовано в рыбоводстве.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к рыбоводству, к способам получения эритроцитарного антигена для диагностики вибриоза рыб.

Вибриоз рыб это опасное бактериальное заболевание. Встречается у 42 видов рыб и гидробионтов в 16 странах мира в солоноватой, морской и пресной воде. Клиническими признаками заболевания являются покраснение кожных покровов, ерошение чешуи, язвы на поверхности тела рыбы, воспаление анального отверстия. При патологоанатомическом вскрытии наблюдаются наличие гнойного эксудата в полости тела рыбы, увелечение и потемнение почек, точечные кровоизлияния в печени. Это заболевание имеет несколько форм течения, от хронического – с покраснением участков наружных покровов и образованием язв на поверхности тела, до острого септического – характеризующегося внезапной гибелью рыб без внешних признаков поражения. В настоящее время отсутствует специфическая профилактика заболевания, а борьба сводится к организационно-хозяйственным и ветеринарно-санитарным мероприятиям.

Технической задачей заявленного изобретения является получение антигена, предназначенного для диагностики вибриоза рыб.

Поставленная задача достигается в способе изготовления эритроцитарного антигена для диагностики вибриоза рыб, включающем приготовление питательных сред, посевного материала, получение сенситина из штаммов Vibrio anguillarum №2 и VUR-19, с последующей сенсибилизацией эритроцитов барана, при этом используют 20% взвесь формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе с pH 7,0-7,4, сенсибилизацию проводят на водяной бане в два этапа, на первом – в течение 60-65 мин при температуре 55-60°С, а на втором – в течение 120-130 мин при температуре 40-42°С, причем эритроциты и сенситин берут в соотношении 1:0,3-1:0,35, антиген расфасовывают во флаконы по 10-20 см³.

Полученный антиген представляет собой жидкость коричневого цвета, которая при хранении расслаивается на прозрачную часть и темно-коричневый осадок. Антиген должен давать четкую положительную реакцию с гомологичной сывороткой и не давать реакцию с гетерологичными сыворотками и физраствором.

Срок годности антигена 18 мес при условии хранения в темном сухом помещении при температуре 4-8°С.

Использование разработанного антигена позволяет своевременно диагностировать вибриоз рыб и успешно бороться с этим заболеванием.

Способ осуществляют следующим образом.

Основные стадии технологического процесса.

Подготовка основного сырья включает приготовление перевара Хоттингера, мясопептонного агара и затем приготовление питательных сред. Готовая питательная среда стерильна, прозрачна, pH 7,4-7,8 и содержит 160-180 мг% аминного азота.

Приготовление посевного материала включает выращивание культур штаммов Vibrio anguillarum №2 и VUR-19 вначале на пробирках с МПА, затем на производственной питательной среде во флаконах емкостью 200-300 см³. Получение матровой расплодки 1-го пассажа: сухие штаммы, полученные из ВГНКИ, ресуспендируют путем внесения в ампулы по 1,0-1,5 мл стерильного МПБ и методом капельного орошения высевают на пробирки с МПА, затем их оставляют на 2-е суток в темном месте при температуре 18-25°С. Затем проводят аналогично получение матровых расплодок 2-го и 3-го пассажа.

По окончании культивирования бакмассу охлаждают и подают на центрифугирование, а затем гомогенизируют в течение 5-6 мин.

Процесс получения сенситина осуществляют путем отделения бакмассы от питательной среды, экстракции антигенов с помощью, например, раствора ледяной уксусной кислоты, отделения экстракта от взвеси микробных клеток и дейтрита на суперцентрифуге, концентрирования антигенов, отделения осадка и приготовления раствора сенситина в оптимальной концентрации для сенсибилизации эритроцитов.

Кровь берут из яремной вены баранов-доноров с последующим получением эритроцитов. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 20% взвесь формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе с pH 7,0-7,4, а сенсибилизацию эритроцитов проводят на водяной бане в два этапа, на первом – в течение 60-65 мин при температуре 55-60°С, а на втором – в течение 120-130 мин при температуре 40-42°С, причем эритроциты и сенситин берут в соотношении 1:0,3-1:0,35. Антиген расфасовывают во флаконы по 10-20 см³.

Пример 1.

Для получения эритроцитарного антигена для диагностики вибриоза рыб готовят питательную среду с pH 7,4 и содержанием 160 мг% аминного азота.

Посевной материал готовят путем выращивания культур штаммов Vibrio anguillarum №2 и VUR-19 вначале на пробирках с МПА, затем на производственной питательной среде во флаконах емкостью 300 см³. Затем получают матровые расплодки 1-го, 2-го и 3-го пассажа.

По окончанию культивирования бакмассу охлаждают и подают на центрифугирование, а затем гомогенизируют в течение 5 мин.

Сенситин получают в процессе отделения бакмассы от питательной среды, экстракции антигенов с помощью, например, раствора ледяной уксусной кислоты, отделения экстракта от взвеси микробных клеток и дейтрита на суперцентрифуге, концентрирования антигенов, отделения осадка и приготовления раствора сенситина в оптимальной концентрации для сенсибилизации эритроцитов.

Кровь берут из яремной вены баранов-доноров с последующим получением эритроцитов. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 20% взвесь формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе с pH 7,0, а сенсибилизацию эритроцитов проводят на водяной бане в два этапа, на первом – в течение 60 мин при температуре 60°С, а на втором – в течение 130 мин при температуре 40°С, причем эритроциты и сенситин берут в соотношении 1:0,3. Антиген расфасовывают во флаконы по 10 см³.

Пример 2.

Проводят аналогично примеру 1, а исключением является то, что сенсибилизацию эритроцитов проводят на водяной бане в два этапа, на первом – в течение 65 мин при температуре 55°С, а на втором – в течение 120 мин при температуре 42°С, причем эритроциты и сенситин берут в соотношении 1:0,35. Антиген расфасовывают во флаконы по 20 см³.

Пример 3.

Проводят аналогично примеру 1, а исключением является то, что сенсибилизацию эритроцитов проводят на водяной бане в два этапа, на первом – в течение 60 мин при температуре 55°С, а на втором – в течение 125 мин при температуре 41°С, причем эритроциты и сенситин берут в соотношении 1:0,35. Антиген расфасовывают во флаконы по 20 см³.

Формула изобретения

Способ изготовления эритроцитарного антигена для диагностики вибриоза рыб, включающий приготовление питательных сред, посевного материала, получение сенситина из штаммов Vibrio anguillarum №2 и VUR-19, с последующей сенсибилизацией эритроцитов барана, при этом используют 20% взвесь формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе с pH 7,0-7,4, сенсибилизацию проводят на водяной бане в два этапа, на первом в течение 60-65 мин при температуре 55-60°С, а на втором – в течение 120-130 мин при температуре 40-42°С, причем эритроциты и сенситин берут в соотношении 1:0,3-1:0,35, антиген расфасовывают во флаконы по 10-20 см³.