Патент на изобретение №2295971

(54) СПОСОБ ТЕРАПИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ХРОНИЧЕСКОГО ТОКСИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и касается терапии экспериментального хронического токсического гепатита. Токсический гепатит у мышей и крыс воспроизводят путем внутрижелудочного введения тетрахлоруглерода на оливковом масле. Терапию осуществляют подкожным введением рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Препарат вводят в дозе 100-125 мкг/кг 1 раз в день, ежедневно, в течение 5 дней. Способ обеспечивает стимуляцию, мобилизацию, миграцию и детерминированный хоминг в печень мезенхимальных стволовых клеток, с их последующей дифференцировкой в зрелые гепатоциты и, как следствие, восстановление функционально активной печеночной ткани. 4 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”М., OOO “РЛС-2004”, с.482, 575. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. – М.: Минздрав РФ, ЗАО “ИИА Ремедиум”, с.24.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и касается способа лечения гепатита.

Заболевания печени и желчевыводящих путей являются весьма распространенными во всем мире и занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и смертности населения нашей страны. Опасность для здоровья и социальная значимость данной патологии печени определяют необходимость постоянной разработки новых эффективных патогенетически обоснованных методов фармакологической терапии и профилактики данных заболеваний.

Известно значительное количество медикаментозных и немедикаментозных способов профилактики и лечения гепатитов. В зависимости от механизма действия гепатопротекторы подразделяются на 4 класса: антиоксидонты, ингибиторы метаболизма ксенобиотиков, препараты фосфолипидов, восстанавливающих мембраны гепатоцитов и стимуляторы метаболических процессов [1, 2].

Предлагаемый способ лечения хронических токсических гепатитов адекватных аналогов по технической сущности среди существующих способов не имеет.

Недостатком извествных способов является низкая эффективность и необходимость назначения большого количества лекарственных средств с разнонаправленными механизмами действия, сопровождаемым высокой ксенобиотической нагрузкой на организм, приводящей к нарушению функционирования систем жизнеобеспечения и появлению тяжелых побочных эффектов препаратов [3].

Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является повышение эффективности восстановления структурно-функционального состояния печени при минимальной лекарственной нагрузке на организм.

Поставленная задача достигается техническим решением, заключающимся в подкожном введении лабораторным животным (крысы, мыши) препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 100-125 мкг/кг 1 раз в день в течение 5 дней.

Новым в данном изобретении является использование препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 100-125 мкг/кг 1 раз в день в течение 5 дней.

Частой причиной гепатобиллиарной патологии на современном этапе развития общества становится воздействие на печень токсических соединений. В окружающей среде известно более 80 тыс. гепатотоксических ксенобиотиков: лекарственных средств, промышленных ядов, пестицидов, пищевых консервантов, спиртсодержащие продукты и средств бытового пользования, с которыми человек контактирует в течение всей жизни [1].

Полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников организма открыли возможность развития новой стратегии лечения многих заболеваний – с помощью стволовых клеток [4]. При этом, согласно имеющимся представлениям, не вызывает сомнения возможность мобилизации собственных механизмов “глубокого резерва” – костномозговых и регионарных стволовых клеток, с помощью различных цитокинов, в том числе гранулоцитарного колониестимулирующего фактора [5].

Вместе с тем способов медикаментозного лечения хронического токсического гепатита с эффективным восстановлением структуры печени за счет стимуляции регенераторных процессов в ней вследствие активации миграции мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в пораженный орган образования в печени полноценных функциональных клеточных элементов de novo в мировой литературе не найдено. В то время как при данной патологии, именно, замещение погибших и быстрое увеличение числа зрелых, способных активно функционировать гепатоцитов, является практической задачей и способно существенно повысить уровень эффективности способа.

Факт применения препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при хроническом токсическом гепатите с достижением нового результата: создание эффективного способа терапии хронического токсического гепатита, для специалиста является не очевидным.

Используемый в предлагаемом изобретении препарат позволяет активировать механизмы “глубокого резерва” и обеспечить восстановление структуры печени путем мобилизации в периферическую кровь и хоминга в зону повреждения костномозговых мезенхимальных стволовых клеток. Подобранные нами условия введения являются оптимальными для эффективного восстановления состояния печени. Данная терапия не требует использования дополнительных лекарственных средств, уменьшая тем самым ксенобиотическую нагрузку на системы жизнеобеспечения организма.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не являющиеся очевидными для специалиста и не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют осуществлять эффективную терапию экспериментального хронического токсического поражения печени, и предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: “Новизна”, “Изобретательский уровень”, “Промышленная применимость”.

Способ осуществляют следующим образом:

Лабораторному животному (крысе, мыши) после окончания моделирования хронического токсического поражения печени в течение 5 дней 1 раз в день подкожно вводят 100-125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рч Г-КСФ).

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на беспородных крысах в количестве 90 штук, массой 250-300 г, и 150 мышах линии CBA/CaLac. Мыши 1 категории, все животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). У крыс гепатит моделировался внутрижелудочным введением 50% раствора CCl₄ (представляющем собой “классический” гепатотропный яд) на оливковом масле в дозе 2 мл/кг в течение 3-х недель 2 раза в неделю (6 раз). У мышей поражение печени вызывали внутрижелудочным введением тетрахлоруглерода (ТХУ) в виде 20% раствора на оливковом масле в объеме 0,2 мл/мышь живого веса по той же схеме. Для оценки состояния печени у крыс оценивали их гибель, прирост массы тела, весовой коэффициент печени на 21-е и 40-е сут (отношение массы органа в мг к массе животного в г). Проводили биохимические исследования содержания в сыворотки крови аспартат-, аланин-аминотрасфераз (АсАТ, АлАТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) на 7, 14, 21, 28 и 40-е сут, а также морфологическое исследование печени на 21-е и 40-е сут [4]. Активность ферментов сыворотки крови определяли по общепринятым методам, используя полуавтоматический биохимический анализатор фирмы Cormay и стандартные наборы фирм Cormay и “Витал Диагностик” (г.Санкт-Петербург). Кровь для исследования получали через катетер, имплантированный в бедренную артерию с последующей перевязкой сосудов. На гистологических препаратах печени, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли количество клеток инфильтрата с помощью окулярной сетки Г.Г.Автандилова [6], содержащей 25 тест-точек. В 20 полях зрения подсчитывали количество клеток инфильтрата, попадающих на тест-точки сетки. Относительную площадь инфильтрации высчитывали как отношение точек сетки, приходящихся на клетки инфильтрата, ко всем точкам сетки в 20 полях зрения (т.е. к 500 точкам). Площадь соединительной ткани определяли с помощью средств компьютерной обработки графических данных. Для этого на стандартной площади среза печени (последовательные микрофотографии 10 полей зрения, выполненные микровидеокамерой “Digital micro”, с программой передачи изображения на компьютер фирмы “Элекард”, Томск) измеряли площадь структур, окрашенных пикрофуксином, и вычисляли процентное отношение к выбранной стандартной площади. Для исследования участия мезенхимальных стволовых клеток в процессах восстановления печени у мышей на 3, 7, 10, 14-е сут после последнего введения тетрахлоруглерода (ТХУ) определяли показатели периферической крови (общее количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула), структурно-функциональную организацию костного мозга, связывающую способность клеточных компонентов костно-мозгового микроокружения в отношении мезенхимальных предшественников, содержание фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф) [7], мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в костном мозге и периферической крови [8], а также количество печеночных клеток-предшественников в печени. Содержание регионарных стволовых клеток в печени (КОЕ-Печ) изучали методом клонирования печеночной ткани в культуральной среде, содержащей: 90% DMEM (“Sigma”, США), 10% неинактивированной ЭТС (“HyClone”, США), 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина (“Sigma”, США), 50 мг/л гентамицина (“Serva”, ФРГ), 8000 МЕ/л гепарина (“Biochemie”, Австрия), 25 мг/л свиного многокомпонентного инсулина (“Novo Nordisk”, Дания) и 10 нг/мл фактора стволовой клетки (SCF) (“Sigma”, США). Материал инкубировали в течение 10 суток в CO₂ инкубаторе (“Jouan”, Франция) при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха. После инкубации под инвертированным микроскопом подсчитывали число колоний. Под колонией подразумевали круглое либо неправильной формы образование, содержащее более 30 клеток. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Частоту встречаемости МСК в костном мозге и периферической крови определяли с помощью обобщенной линейной модели для распределения Пуассона. Соответствие данных лимитирующих разведении одномерной модели Пуассона оценивалось посредством линейной log-log регрессии. При этом теоретическая фракция отрицательных лунок _i распределялась как _i=exp(-fx_i), где f – частота встречаемости МСК, xi – количество клеток, высаженных в лунку [8, 9]. Использовалась программа Statistica 6.0.

Пример 1.

У крыс гепатит моделировался внутрижелудочным введением 50% раствора CCl₄ на оливковом масле в дозе 2 мл/кг в течение 3-х недель 2 раза в неделю (6 раз). У мышей поражение печени вызывали внутрижелудочным введением тетрахлоруглерода (ТХУ) в виде 20% раствора на оливковом масле в объеме 0,2 мл/мышь живого веса по той же схеме. Животным экспериментальной группы сразу после моделирования хронического токсического гепатита (на 19-е сут эксперимента) подкожно 1 раз в день в течение 5 дней вводили 100 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (НИКТИ БАВ “Вектор”, Новосибирск) – растворенного в 0,5 мл растворителя. Животным контрольной группы по той же схеме вводили физиологический раствор по 0,5 мл. Проведенные эксперименты показали, что гибель крыс в группах, которым вводили дистиллированную воду и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, началась одновременно – после 3-го введения CCl₄ и к концу эксперимента в контрольной группе составила 21,2%, а при назначении препарата 15,1% от исходного количества животных, при этом данные различия по отношению к контролю были статистически значимы. На вскрытии у погибших животных печень была увеличена в размере, желтого цвета, глинистой консистенции с очагами кровоизлияний и макроскопическими признаками острой дистрофии печени. При этом при применении рчГ-КСФ процент прироста массы тела крыс был достоверно выше, чем в контроле (табл. 1). В то же время межгрупповых различий в весовом индексе печени не наблюдалось. Результаты биохимических исследований сыворотки крови показали повышение активности АлАТ, АсАТ и ЩФ на 7, 14, 21, 40-е сут опыта после начала введения ТХУ в контрольной группе. В то время как у крыс, получавших рчГ-КСФ на 19 день эксперимента, концентрация данных ферментов в сыворотке крови на 28-е и 40-е сут опыта была достоверно ниже, чем у животных, которым вводили растворитель, и достигала уровень фоновых значений (табл.2). При исследовании гистологических препаратов печени крыс, окрашенных гематоксилином и эозином, в контрольной группе отмечалось выраженное нарушение долькового строения печени. На препаратах были видны поля грануляционной ткани, замещающей погибшие гепатоциты, в которых происходило новообразование сосудов и печеночных протоков. В большом количестве встречались тельца Каунсильмена, а в сохранившихся гепатоцитах выраженная крупнокапельная жировая дистрофия. При этом отдельные клетки, сливаясь, образовали жировые кисты. В то же время имела место значительная регенерационная гипертрофия печеночных клеток и обилие митозов гепатоцитов. Инфильтрация носила диффузный характер, и ее относительная площадь составляла 27,48±4,67% и 25,40=1,2% на 21-е и 40-е сут соответственно. Вместе с тем относительная площадь соединительной ткани была равна 6,43±1,22% и 5,75±0,42% в те же сроки (табл.3). Введение рчГ-КСФ при моделировании CCl₄-гепатита сохраняло дольковое строение печени. При этом тельца Каунсильмена встречались лишь в единичных случаях, а жировая дистрофия гепатоцитов была преимущественно мелкокапельная. В то же время отмечалась, хотя и менее значительная, но все же существенная инфильтрация портальных трактов. Хотя инфильтрат, как правило, не проникал внутрь долек. В целом, относительная площадь инфильтрации была достоверно ниже, чем в контрольной группе (более чем в два раза). Кроме того, препарат рчГ-КСФ в 3 раза уменьшал и площадь соединительной ткани (1,89±0,32% и 1,44±0,17% на 21-е и 40-е сут соответственно) (см. табл.3). Таким образом, исследования состояния печени у крыс, получавших препарат после окончания моделирования хронической токсической патологии печени, с помощью биохимических и морфологических методов выявило у рчГ-КСФ значительную гепатопротекторную активность. Данный препарат оказывал выраженное противовоспалительное и антисклеротическое действие. Дальнейшим этапом исследований с целью изучения механизмов гепатопротекторного действия препаратов в экспериментах на мышах изучали влияние препарата на состояние пула костно-мозговых, циркулирующих и регионарных стволовых клеток. Так как, именно активация, мобилизация и миграция в печень истинных стволовых клеток костного мозга (“глубоких” резервных механизмов компенсации) способны повысить эффективность способа. Отражением активности функционального состояния стволовых клеток костного мозга зачастую служат изменения клеточности периферической крови, при этом самыми ранними чаще всего являются сдвиги количественного и качественного состава лейкоцитов, представляющих собой наиболее мобильные клеточные элементы системы крови.

Проведенные эксперименты показали, что курсовое введение ТХУ и параллельное введение дистиллированной воды на протяжении практически всего периода наблюдения сопровождалось достоверным снижением общего количества лейкоцитов за счет уменьшения числа палочкоядерных и сегментоядерных форм нейтрофилов в периферической крови. Вместе с тем введение препарата после окончания моделирования гепатита на 10, 14-е сут приводило к еще более выраженному падению общего количества лейкоцитов. При этом, однако, данные изменения были связаны не столько с уменьшением числа полиморфноядерных клеток в периферической крови, сколько со снижением количества мононуклеаров: моноцитов (на 7, 10, 14-е сут) и лимфоцитов практически во все сроки наблюдения. Описанная динамика содержания различных форм лейкоцитов как в контрольной, так и в опытной группах, вероятно, была обусловлена токсическим влиянием самого ТХУ на кроветворную ткань и активизацией (особенно выраженной при введении препаратов) перераспределительных реакций в системе крови, касающихся, в первую очередь, процессов миграции мононуклеаров (фракции клеточных элементов, в состав которой входят стволовые клетки). При культуральных исследованиях механизмов компенсации “глубокого” резерва в контрольной группе было обнаружено увеличение количества в костно-мозговой ткани КОЕ-Ф на 7, 10-е сут исследования, в состав которых входят как предшественники стромальных элементов, так и истинные СК, что подтверждалось возрастанием числа мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в гемопоэтической ткани в те же сроки наблюдения (до 279,1% и 291,7% от фона на 7, 10-е сут соответственно) (табл.4). Указанные изменения состояния пула СК, очевидно, являлись неспецифическими и были связаны с активацией стресс-реализующих систем при формировании патологии печени с помощью токсического агента. Кроме того, отмечалось увеличение содержания клеток-предшественников фибробластов в периферической крови на 7, 10, 14-е сут опыта и возрастание числа МСК на 3-е сут, свидетельствующее о мобилизации стволовых клеток различной степени зрелости при данном виде воздействия, представляющем по своей сути воздействие экстремального характера (табл. 7, 8). Вместе с тем исследование динамики содержания регионарных клеток-предшественников в печени выявило снижение числа КОЕ-Печ, достигающее статистической значимости на 10-е сут опыта, сменяющееся достоверным возрастанием их количества лишь к концу эксперимента (14-е сут) (см. табл.4), когда токсические эффекты яда были уже, очевидно, устранены. В целом, полученные результаты свидетельствуют об активации механизмов компенсации “глубокого резерва” – костно-мозговых стволовых клеток – при хронической интоксикации ТХУ, которые, однако, в данном случае оказываются недостаточными и/или несостоятельными для репарации печеночной ткани, нивелирующей повреждающее воздействие CCl₄. Исследование возможной стимуляции данных компенсаторно-приспособительных механизмов при патологии печени с помощью введения рчГ-КСФ показало увеличение содержания в костном мозге МСК на 3-е сут опыта на фоне возрастания в нем числа КОЕ-Ф (3, 7-е сут). При этом препарат оказывал выраженное влияние на выход МСК в периферическую кровь и на мобилизацию КОЕ-Ф (3-е сут). Выявленные изменения в состоянии пула стволовых клеток гемопоэтической ткани и периферической крови, свидетельствующие о мобилизации и миграции МСК, сопровождались их хомингом в печеночную ткань, проявляющимся выраженным увеличением количества клеток-предшественников в печени на 10-е и 14-е сут под влиянием рчГ-КСФ (см. табл.4). В целом, исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что рч Г-КСФ приводил к выраженным и четко направленным на стимуляцию процессам восстановления поврежденной печени изменениям функционального состояния мезенхимальных стволовых клеток. Таким образом, препарат рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора оказывал выраженные гепатопротекторные свойства, осуществляемые, за счет стимуляции, мобилизации, миграции и детерминированного хоминга в печень мезенхимальных стволовых клеток с их последующей дифференцировкой в зрелые гепатоциты.

Предлагаемый способ позволяет лечить хронический токсический гепатит, достигая эффекта быстрого восстановления функционально активной печеночной ткани путем стимуляции, мобилизации, миграции и детерминированного хоминга в печень мезенхимальных стволовых клеток с их последующей дифференцировкой в зрелые гепатоциты.

Источники информации

1. Венгеровский А.И. Эффективность и механизм действия гепатопротекторов при экспериментальном токсическом повреждении печени: Дисс… доктора мед. наук. – Томск, 1991. – С.4-57.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.1. – М.: Медицина, 1996. – 624 с.

3. Зборовский А.Б., Тюренков И.Н. Осложнения фармакотерапии. – М.: Медицина, 2003. – 543 с.

4. Holtzer H. Cell lineages, stem cells and the quantal cell cycle concept / Stem cells and tissue homeostasis. Eds: B.I.Lord, C.S.Poten, RJ.Cole. – New York, Cambrige Unyversity Press, 1978. – P.1-28.

6. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. – М.: Медицина, 1990. – 382 с.

7. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. – Томск: Изд-во ТГУ, 1992. – 272 с.

Таблица 1 Динамика общей массы крыс-самцов, г (числитель) и прирост массы, % (знаменатель)
№ группы	До введения	7 сутки	14 сутки	21 сутки	28 сутки	40 сутки
Н2О (контроль)	377,1±10,7
Г-КФС	365,0±7,3
* – отмечена достоверность различия показателя от фоновых значений при р0,05;
# – отмечена достоверность различия показателя от контрольных значений при р0,05.

Таблица 2 Биохимические показатели крови крыс-самцов после введения препаратов, Х±m
Показатели, сроки опыта (сутки)
		Н2О (контроль)	Г-КСФ
АлАТ, мккат/л	7-е	2,78±	2,67±
		0,09*	0,07*
	14-е	2,8±	2,51±
		0,07*	0,04*
	21-е	1,22±	0,96±
		0,07*	0,09
	28-е	0,45±	0,37±
		0,02*	0,01*#
	40-е	0,72±	0,54±
		0,02*	0,03#
АсАт мккат/л	7-е	3,10d±	3,30±
		0,35*	0,1*
	14-е	2,4±	2,51±
		0,09*	0,06*
	21-е	0,71±	0,74±
		0,08	0,02*
	28-е	0,40±	0,33±
		0,01*	0,01*#
	40-е	0,71±	0,60±
		0,03*	0,01#
ЩФ, Е/л	7-е	947,4±	907,0±
		97,7*	39,2*
	14-е	1283,1±	1214,9±
		172,6*	33,0*
	21-е	1262,4±	1374,4±
		137,3*	39,3*
	28-е	407,7±	315,9±
		8,45*	18,2#
	40-е	554,2±	306,1±
		65,3*	44,2#
* – отмечена достоверность различия показателя от фоновых значений при р0,05;
# – отмечена достоверность различия показателя от контрольных значений при р0,05.

Таблица 3 Влияние препаратов на морфологию печени крыс с хроническим CCl4 – гепатитом
Сроки исследования	Относительная площадь инфильтрата (%)		Относительная площадь соед. ткани (%)
	21 сутки	40 сутки	21 сутки	40 сутки
Н2О (контроль)	27,48±4,67*	25,40±1,2*	6,43±1,22*	5,75±0,42*
Г-КСФ	10,0±1,16*#	11,66±0,7*#	1,89±0,32*#	1,44±0,17*#
* – отмечена достоверность различия показателя от фоновых значений при р0,05;
# – отмечена достоверность различия показателя от контрольных значений при р0,05.

Таблица 4 Состояние пула стволовых клеток мышей линии CBA/CaLac, получавших препарат Г-КСФ на фоне моделирования CCl4-гепатита (X±m)
Сроки исследования/сутки	Группы	КОЕ-Печ, на105 нуклеаров	МСК в периферической крови, на 106 миелокариоцитов	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	КОЕ-Ф в перимерической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов
3-е	фон	55,6±3,85	31±7	24±4	6,50±0,99	15,17±1,30
	Контроль (H2O)	67,8±6,39	63±10*	39±9	4,83±1,01	12,83±1,17
	Г-КСФ	54,2±3,99	121±17*#	79±9*	6,83±1,01#	33,00±1,51*#
7-е	Контроль (H2O)	58,25±4,05	–	161,7±8*#	13,17±0,79*	28,29±6,91*
	Г-КСФ	48,0±3,58	–	171±31*	14,5±0,98*	59,85±3,69*#
10-е	Контроль (H2O)	40,8±1,02*	–	70±12*	13,00±1,00*	31,56±2,01*
	Г-КСФ	93,4±3,78*#	–	78±14*	12,00±1,63*	32,56±2,93*
14-е	Контроль (H2O)	102,0±5,46*	–	32±8	18,50±1,18*	14,17±2,23
	Г-КСФ	134,0±2,4*#	–	35±7	32,00±2,31*#	17,50±0,56
* – отмечена достоверность различия показателя от фоновых значений при р0,05; # – отмечена достоверность различия показателя от контрольных значений при р0,05.

Формула изобретения

Способ терапии экспериментального хронического токсического гепатита, включающий введение рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора один раз в день, отличающийся тем, что его вводят подкожно в дозе 100-125 мкг/кг в течение 5 дней.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 06.07.2007

Извещение опубликовано: 20.02.2009 БИ: 05/2009