Патент на изобретение №2295728

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛАККАЗЫ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способам исследования грибов, и может быть использовано для определения активности фермента лакказы мицелия базидиальных грибов при селекционном процессе. Способ включает инокуляцию мицелия базидиальных грибов на питательную среду. Питательная среда содержит целлюлозу, минеральные соли и -нафтол в количестве 0,08-0,12 г/л, инкубирование проводят трое суток и оценку активности проводят по линейным размерам появившихся на питательной среде окрашенных зон и интенсивности их окраски денситометрически. Способ позволяет упростить технологический процесс, сократить продолжительность анализа и затраты на реактивы и труд. 1 ил., 1 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способам исследования грибов, и может быть использовано для определения активности фермента лакказы мицелия базидиальных грибов при селекционном процессе.

Недостатками данного способа являются его значительная трудоемкость и технологическая сложность выполнения данного способа, большой период культивирования мицелиальной культуры и большие объемы сред для культивирования, что увеличивает продолжительность выполнения анализа и материальные затраты.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ определения активности лакказы базидиальных грибов, включающий инокуляцию мицелия базидиальных грибов, на агар – солодовую питательную среду, содержащую -нафтол, инкубирование инокулированных чашек до образования окрашенных цветных пятен (Методы экспериментальной микологии. Справочник / под ред. В.И.Билай/ – Киев: Наукова думка, 1982. с.176).

Однако указанный способ не предусматривает возможности изучения динамики образования фермента мицелием базидиальных грибов в процессе роста.

Техническим результатом заявленного изобретения является упрощение технологического процесса определения активности лакказы базидиальных грибов, изучение свойств грибов на питательной среде с естественным источником углерода, сокращение продолжительности анализа и материальных затрат на реактивы и труд.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения активности лакказы базидиальных грибов, включающем инокуляцию мицелия базидиальных грибов на питательную среду, содержащую растительный источник углерода, агар и -нафтол, инкубирование, оценку результатов, питательная среда дополнительно содержит минеральные соли, количество -нафтол составляет 0,08-0,12 г/л, инкубирование проводят в течение трех суток и оценку активности проводят по линейным размерам, появившихся на питательной среде окрашенных зон и интенсивности их окраски денситометрически.

Новизна заявленного изобретения обусловлена введением в питательную среду целлюлозы в качестве источника углерода, что дает возможность исследовать активность лакказы базидиальных грибов на естественном источнике углерода, установлением оптимальной концентрации -нафтола, определение активности лакказы путем измерения линейных размеров и интенсивности окрашенных зон питательной среды денситометрически, инкубация проводится в течение 3 суток, а не 14 как в известных способах.

Сущность изобретения поясняется фотографией, где представлены окрашенные зоны в зависимости от активности лакказы.

Пример конкретного осуществления способа определения активности лакказы базидиальных грибов.

Мицелий изучаемого штамма гриба Pleurotus ostreatus инокулируют на агаризованную питательную среду следующего состава: в качестве источника углерода целлюлоза (измельченная фильтровальная бумага) – 5 г/л, минеральные соли, например (NH₄)₂SO₄ – 4 г/л, КН₂PO₄ – 0,5 г/л, MgSO₄·7Н₂O – 0.3 г/л и -нафтол в концентрации 0,08-0,12 г/л. Данная концентрация -нафтола является оптимальной, что было установлено экспериментально. При увеличении концентрации происходит гибель мицелия, а при уменьшении концентрации образования цветных пятен на питательной среде не происходит. Также в питательную среду входит затвердитель – агар – 15 г/л. рН среды 5,5-6,0.

Инкубацию проводили в темноте в термостате при 25°С в течение трех суток. Оценку проводили на четвертые сутки, измеряя диаметр образовавшихся окрашенных зон на питательной среде и определяя интенсивность их окрашивания денситометрически. В течение трех суток мицелиальная колония разрасталась в радиальном направлении, образовывая окрашенные радиальные зоны. Среда под воздействием фермента лакказы, выделяемой грибом Pleurotus ostreatus, окрашивается в фиолетовый цвет (фото). Определение интенсивности окраски образующихся зон на питательной среде проводили денситометрически: получение изображения реверзума чашки Петри сканирующим цифровым устройством с последующей обработкой в программе Сорбфил Денситометр 1.4 на компьютере.

Использование предлагаемого изобретения позволяет снизить затраты труда и времени на проведение анализов по определению активности лакказы у базидиальных грибов, уменьшить расход реактивов, не требуется использования дорогостоящего оборудования, возможно проведение массового анализа. Но при этом сохраняется эффективность способа как и у известных способов определения лакказной активности базидиальных грибов: выявляются четкие различия в активности мицелиальных изолятов, сохраняется высокая воспроизводимость опыт, результаты представляются в численном выражении, кроме того, изучение возможно проводить в условиях, максимально приближенных к естественным. Эффективность способа иллюстрируется результатами исследований, представленными в таблице определения активности лакказы мицелия штаммов вешенки обыкновенной НК-35 и Львовский, а также монокариотических изолятов, полученных из них (см. таблицу)

Таблица. Зависимость активности лакказы от генотипа монокариотических изолятов гриба Pleurotus ostreatus (Вешенка обыкновенная)
№ изолята	Диаметр окрашенной зоны, мм	Результат денситомет рирования	№ изолята	Диаметр окрашенной зоны, мм	Результат денситомет рирования
Дикариотический НК-35 (St)	20,7	4370543	Дикариотический Львовский (St)	30	5270763
НК-2	15,7+	2310056	Л1	25+	4453264
НК-5	13,3+	2290861	Л2	24,3+	4207093
НК-6	22,3×	4500879	Л3	18,3	3179526
НК-7	16,7+	2468478	Л4	24,3+	4329865
НК-8	16,3+	2156869	Л7	19,7+	3432568
НК-9	22,3×	4370849	Л8	22,3+	4423568
НК-10	10+	1115235	Л11	30×	5354367
НК-15	20,7×	4345274	Л12	5+	1013256
НК-16	21×	4263487	Л14	25,7+	4586954
НК-17	25	4643254	Л19	27×	5234876
НК-18	6,7+	1145897	Л20	16+	2514446
НК-21	13+	2547823	Л25	13,3+	2265387
НК-23	20×	4210005	Л26	28,7×	5620788
НК-24	24,7	4573256	Л27	9,3+	1130650
НК-25	13,3+	2410574	Л28	17+	2795684
НК-26	23,3×	4519058	Л30	20+	4035698
НК-27	10,5+	1253678	Л34	16,7+	2510364
НК-28	27,7	5348421	Л35	21,3+	4270567
НК-29	18,7×	3156354	Л36	22+	4328697
НК-30	9+	1232265	Л38	10+	1352468
НК-31	17+	2970345	Л39	19,7+	4132564
НК-32	24,7	4310250	Л49	17+	2863547
НСР05	3,6		–	3,6
Обозначения: × – на уровне стандарта; – достоверно превышает стандарт; + – достоверно меньше стандарта.

В качестве стандарта (St) для осуществления способа определения активности фермента лакказы базидиальных грибов можно использовать любой ди- или монокариотический мицелий, сравнение с которым проводят. В нашем примере в качестве стандарта использовали два дикариотических мицелия штаммов НК-35 и Львовский, которые являются родительскими для исследуемых в примере монокариотических изолятов.

Использование данного способа определения активности лакказы базидиальных грибов на твердой агаризованной среде, содержащей целлюлозу, позволяет определять активность фермента лакказы живой мицелиальной культуры гриба в процессе роста и развития на питательной среде с естественным источником углерода. Сокращает продолжительность процесса, снижает материальные затраты и затраты труда.

Формула изобретения

Способ определения активности лакказы базидиальных грибов, включающий инокуляцию мицелия базидиальных грибов на питательную среду, содержащую растительный источник углерода, агар и -нафтол, инкубирование, оценку результатов, отличающийся тем, что в качестве растительного источника углерода используют целлюлозу, питательная среда дополнительно содержит минеральные соли, количество -нафтола составляет 0,08-0,12 г/л, инкубирование проводят в течение трех суток и оценку активности проводят по линейным размерам появившихся на питательной среде окрашенных зон и интенсивности их окраски денситометрически.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.06.2007

Извещение опубликовано: 20.02.2009 БИ: 05/2009