Патент на изобретение №2295565
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЖИВОТНЫХ IN VITRO
(57) Реферат:
Изобретение относится к клеточной инженерии. Выделяют клетки молочной железы. Культивируют их на субстрате в течение 2-3 суток. Обрабатывают клетки красителем Hoechst 33342 непосредственно на субстрате. Микроскопируют их в ультрафиолетовом свете с длиной волны 350 нм. Способ позволяет эффективно определять стволовые клетки молочной железы in vitro с последующим учетом их морфологических признаков. 1 табл., 2 ил.
Изобретение относится к клеточной инженерии, в частности к способам определения стволовых клеток молочной железы животных. Известен способ определения стволовых клеток в органах животных по таким морфологическим признакам, как наличие диффузного хроматина в ядре, имеющем одно или несколько ядрышек, наличие большого числа свободных рибосом в цитоплазме и незначительное количество других органелл, а также присутствие у многих стволовых клеток цитоплазматических отростков (Гурвич А.Е., Егоров И.К., Кяйвяряйнен А.И. Иммуногенез и клеточная дифференцировка. – М.: Наука, 1978. – 232 с. Райцина С.С. Идентификация стволовых клеток в некоторых системах клеточных дифференцировок у млекопитающих / Успехи современной биологии, 1980, Т.90, вып. 1(4). – с.123-137.). Выявление таких клеточных особенностей в ряде случаев носит затруднительный характер, так как связано с использованием дорогостоящего оборудования, кроме того, клетки с подобным фенотипом не всегда являются стволовыми. 1pos Известен способ определения стволовых клеток животных in vitro no повышенной активности щелочной фосфатазы (Савченкова И.П. Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее. – Дубровицы, 1999. – 95 с.). Это свойство характерно для всех стволовых клеток и часто используется для доказательства принадлежности клеток к этой группе. К недостаткам этого метода относится невозможность дальнейшей работы с клетками, так как в процессе анализа они погибают. При создании настоящего изобретения задача заключалась в том, чтобы разработать способ, позволяющий определять стволовые клетки in vitro с последующим учетом их морфологических признаков. Технический результат изобретения заключается в том, что предложен способ определения стволовых клеток молочной железы животных in vitro, включающий выделение клеток молочной железы и последующую их обработку Hoechst 33342, особенностью которого является то, что после выделения клеток молочной железы проводят их культивирование, а затем, не снимая с субстрата, обрабатывают красителем Hoechst 33342. Для прижизненной идентификации и селекции стволовых клеток в молочной железе предложено использование флуоресцентного красителя Hoechst 33342 для определения стволовых клеток молочной железы в монослое. Пример. Стволовые клетки в монослое выявляли путем применения следующих процедур: 1) отбирали ткань молочной железы крольчих сразу после забоя животных или прижизненно методом биопсии; 2) проводили истощение тканей посредством измельчения материала и последующей обработки 0,1% раствором коллагеназы в течение 30-40 мин при 37°С, а затем 0,25% раствором трипсина в течение 10-15 мин при 37°С; 3) осаждали клетки центрифугированием при 1 тыс. об/мин в течение 5 минут; 4) полученную первично трипсинизированную культуру клеток молочной железы выращивали в среде DMEM/F-12 1:1 с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FCS), 2mM 5) после кратковременного культивирования в течение 2-3 суток клетки, не снимая с субстрата, обрабатывали Hoechst 33342 следующим образом. Ростовую среду сливали, промывали подогретой средой DMEM без сыворотки, затем заливали клетки подогретой средой DMEM с 2% FCS и 10 mM HEPES, дополненную Hoechst 33342 с конечной концентрацией 5 мкг/мл. Окрашивание производили в течение 90 мин при 37°С. Затем клетки заливали холодным раствором Хэнкса с 2% FCS и 10 mM HEPES и микроскопировали в УФ с длиной волны 350 нм. Клетки, окрашенные Hoechst 33342, идентифицировали по характерному красному свечению (фильтр Hoechst Red). Контрольное использование предложенного способа для идентификации стволовых клеток в монослое показало, что Hoechst-положительные клетки идентифицировались только среди клеток со стволово-подобным фенотипом, при этом не все клетки с характерным фенотипом флуоресцировали. В культуре клеток молочной железы кроликов было отмечено три типа клеток: крупные и мелкие круглые клетки с большим ядром и узким ободком цитоплазмы, которые интенсивно окрашивались по Гимза, фибробластоподобные клетки, имеющие веретенообразную форму. С использованием предложенного нами способа было установлено, что стволовые элементы молочной железы кролика идентифицируются среди мелких круглых клеток с большим ядром и узким ободком цитоплазмы (чертеж), причем в процессе культивирования их число снижается (табл.).
Коэффициент корреляции между числом мелких круглых клеток и Hoechst-положительных клеток был довольно высоким и составил 0,832. Предложенный нами способ может быть использован в биотехнологии животных для витальной идентификации стволовых клеток молочной железы с целью их последующего использования для трансплантации, клонирования и т.п. Предложенный нами способ в сочетании с методом выделения Hoechst-положительных клеток, например с использованием проточной цитометрии или какого-либо другого метода, позволит повысить результативность работ в области клеточной терапии и клонирования с использованием клеток молочной железы.
Формула изобретения
Способ определения стволовых клеток молочной железы животных in vitro, включающий выделение клеток молочной железы и последующую их обработку красителем Hoechst 33342, отличающийся тем, что после выделения клеток молочной железы проводят их культивирование на субстрате в течение 2-3 суток, затем обрабатывают клетки красителем непосредственно на субстрате и микроскопируют в ультрафиолетовом свете с длиной волны 350 мм.
РИСУНКИ
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
-глутамина, 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 5 мг/мл инсулина и гентамицина с конечной концентрацией 50 мкг/мл при 37°С в атмосфере с 5% СО2;