Патент на изобретение №2294965

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ТИПИЧНОСТИ ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ И УРОВНЯ ГИБРИДНОСТИ СЕМЯН F1 ПОДСОЛНЕЧНИКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к способам определения генотипа растительного материала и может быть использовано в селекции подсолнечника. Из каждого проростка в группе семян растения подсолнечника выделяют ДНК, которую затем амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции. Амплификацию осуществляют по микросателлитным локусам НА 432, НА 514, НА 1442 и ORS 5 с использованием праймеров, соответствующих фланкирующим областям этих локусов. Продукты амплификации разделяют электрофорезом в окрашенном, например агарозном геле. Визуальное сравнение электрофоретических спектров, например, в ультрафиолетовых лучах позволяет на высоком уровне оценить типичность или гибридность исследуемой пробы по количеству однотипных спектров. 4 з.п. ф-лы, 3 ил.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”05.03.1998. Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания: Методические указания. – М.: Федеральный центр Госсанэпидемнадзора Минздрава России, 2004.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции и семеноводстве подсолнечника.

Подсолнечник – важнейшая масличная культура России. Наряду с селекцией сортов-популяций в настоящее время большую значимость приобрела селекция гибридов этой культуры. Для поддержания высокой эффективности линейно-гибридной селекции необходимы мониторинг генетической чистоты инбредных линий и уровня гибридности семян F₁. Для решения этих задач возможно использование традиционного метода грунт-контроля, что требует значительной затраты времени и посевных площадей. Кроме этого, оценка по морфологическим признакам в значительной степени зависит от условий окружающей среды. В некоторой степени эти задачи решаются при помощи анализа полиморфизма запасных белков и изоферментов. Но ограниченное число выявленных белковых маркеров и высокая стоимость полного изоферментного анализа для семян подсолнечника не удовлетворяют требованию полной оценки типичности и гибридности семенного материала. Общепризнанно, что наиболее перспективные системы маркирования семенного и селекционного материала основаны на оценке полиморфизма ДНК. В частности, микросателлитные повторы ДНК (SSR), расположенные в геноме случайным образом, обладают высоким уровнем полиморфизма, кодоминантны. Применение SSR маркеров дает возможность повысить уровень идентификации генотипов, оценки типичности и гибридности семян.

Известен «Способ маркирования селекционных достижений клевера лугового на основе RAPD-маркеров» (Патент РФ №2244416 по заявке №2002102791/13 от 06.02.2002 г., А 01 Н 1/04, публ. 20.01.2005 г., Бюлл. №2), заключающийся в оценке ДНК-полиморфизма RAPD-методом с использованием набора 10-членных праймеров. Согласно этому способу на основе оценки продуктов амплификации ДНК выбирают присущие только для данного сорта профили, служащие маркерами селекционного достижения.

Недостатком известного способа является плохая воспроизводимость результатов и вытекающая отсюда невозможность точного определения типичности инбредных линий и гибридности семян F₁ подсолнечника.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является «Способ установления типичности и уровня гибридности генотипов подсолнечника» (Патент Украины №63 265 А по заявке №2003032413 от 20.03.2003 г., публ. 15.01.2004 г. Бюл. №1. Авторы: Сиволап Ю.М. и Солоденко А.Е.). В соответствии с известным способом отбирают пробу, состоящую из 100 штук семян исследуемой партии оных, проращивают их в течение 3-х суток, выделяют ДНК из каждого проростка, проводят амплификацию ДНК по выбранным микросателлитным локусам ORS 78, ORS 509, ORS 595, ORS 815 с использованием соответствующих им фланкирующих последовательностей прямого и обратного праймеров при помощи полимеразной цепной реакции, разделяют продукты амплификации на фракции методом электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле, окрашенном по определенной методике с применением азотно-кислого серебра, и визуализируют фрагменты ДНК (гель помещают на 5 минут в 10%-ный этанол, переносят в 1%-ный раствор HNO₃ на 3 минуты, промывают несколько раз дистиллированной водой, вымачивают 20 минут в AgNO₃ в темноте, промывают несколько раз дистиллированной водой, инкубируют гель в растворе (0,28 М NaCO₃ (безводный), 0,019% формалин), заменяя раствор каждый раз при его потемнении до появления фрагментов амплификации, промывают несколько раз бидистиллированной водой), а типичность и уровень гибридности генотипов подсолнечника устанавливают путем подсчета количества растений с одинаковым аллельным составом, т.е. по количеству однотипных спектров.

Недостатком прототипа является недостаточно широкий набор локусов, используемых при проведении анализа на типичность линий и гибридность семян F₁ подсолнечника, что ограничивает количество анализируемых генотипов, кроме того, канцерогенность используемого в прототипе полиакриламидного геля, трудоемкость его приготовления снижают эффективность способа.

Задача, решаемая заявленным изобретением, состоит в повышении уровня идентификации генотипов, оценки типичности и гибридности семян F₁ подсолнечника за счет увеличения числа используемых микросетеллитных локусов, полиморфных для линий и гибридов подсолнечника, а также в повышении эффективности способа за счет упрощения операции разделения продуктов амплификации и улучшения работы персонала при проведении анализа.

Цель изобретения – расширение арсенала локусов, рекомендуемых для оценки типичности инбредных линий и уровня гибридности семян F₁ подсолнечника, а также снижение канцерогенности геля, используемого для электрофореза, и упрощение его окрашивания.

Технический результат достигается тем, что в известном способе установления типичности и уровня гибридности генотипов подсолнечника, включающем отбор пробы, состоящей из 100 штук семян исследуемой партии оных, их проращивание не менее 3 суток, выделение ДНК из каждого проростка, проведение амплификации ДНК по выбранным микросателлитным локусам с использованием фланкирующих их праймеров при помощи полимеразной цепной реакции, разделение продуктов амплификации на фракции методом электрофореза в окрашенном геле, визуальное сравнение электрофоретических спектров и оценка типичности или гибридности пробы по количеству однотипных спектров, согласно изобретению амплификацию ДНК проводят по следующему набору микросателлитных локусов с использованием фланкирующих их праймеров:

причем, для разделения продуктов амплификации используют агарозный гель, который окрашивают бромистым этидием путем непосредственного добавления последнего в него, а визуальное сравнение электрофоретических спектров осуществляют в лучах ультрафиолетового света.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ оценки типичности инбредных линий и уровня гибридности семян F₁ подсолнечника отличается от известного условиями осуществления действий, а именно: используемыми веществами. Так, в известном способе при проведении ПЦР используют следующие микросателлитные локусы: ORS 78, ORS 509, ORS 595, ORS 815, а также «свои» фланкирующие их (локусов) праймеры. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию патентоспособности НОВИЗНА.

Исследуя уровень техники в процессе проведения патентного поиска по всем видам сведений, общедоступных в печати, мы не выявили отличительного от прототипа признака, касающегося набора микросателлитных локусов и фланкирующих их праймеров при проведении амплификации ДНК. Заявляемый способ, включающий заявленную совокупность признаков, для специалиста в области селекции и семеноводства подсолнечника явным образом не следует из известного на сегодня существующего уровня техники. Нашими исследованиями было выявлено, что заявляемые последовательности праймеров фланкируют соответствующие им локусы, которые обладают достаточным уровнем полиморфизма в различных генотипах подсолнечника для их идентификации и последующей оценки типичности. Локусы этого набора имеют кодоминантное наследование, что позволяет их использовать в оценке уровня гибридности с использованием фланкирующих их праймеров, соответствующих заявленным (прямым и обратным).

На основании этого можно сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения критерию патентоспособности ИЗОБРЕТАТЕЛЬСКИЙ УРОВЕНЬ.

Заявляемое техническое решение соответствует и критерию патентоспособности ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ, т.к. оно может быть использовано в сельском хозяйстве. И, кроме того, в описании изобретения представлены средства и методы, с помощью которых возможно осуществление технического решения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения.

Способ осуществляют следующим образом.

Для оценки типичности семян инбредной линии или уровня гибридности семян F₁ подсолнечника отбирают стандартным методом из исследуемой семенной партии инбредной линии или гибрида F₁ пробу, состоящую из 100 штук семян, проращивают их не менее 3 суток и из каждого проростка выделяют ДНК любым известным методом, по известной методике проводят амплификацию ДНК отобранных семян по заявленным микросателлитным локусам с использованием фланкирующих их праймеров при помощи ПЦР.

Полученные продукты амплификации разделяют на фракции методом электрофореза в окрашенном геле по стандартной методике. Полученные электрофоретические спектры визуально сравнивают и по количеству однотипных спектров оценивают типичность линии или гибридность семян F₁ подсолнечника.

Примеры осуществления способа.

Пример №1. Оценка типичности инбредной линии ВК 678.

Для оценки типичности партии семян инбредной линии ВК 678 стандартным способом отбирали пробу, состоящую из 100 семян. Семена проращивали в течение 5 суток в рулонах фильтровальной бумаги в термостате при температуре +24°С.

Из каждого полученного проростка проводили выделение ДНК стандартным методом. Для этого брали навески массой по 0,2 г от каждого проростка и гомогенизировали в фарфоровой ступке с добавлением 0,9 мл лизирующего буфера, содержащего 20 мМ Na EDTA; 01M трис-HCl рН 8,5; 14М NaCl, 20% СТАВ. Полученную массу переносили в чистую пластиковую пробирку и инкубировали при температуре 65°С в течение 60 мин, периодически перемешивая. Далее, добавляли 0,45 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (в соотношении 24:1 по объему), перемешивали в течение 10 мин. Затем центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин. Водную фазу переносили в чистые пробирки. Процедуру повторяли дважды. К полученному субнатанту добавляли по 7 мкл раствора РНК-зы и инкубировали при 37°С 60 мин для разрушения молекул РНК. ДНК осаждали добавлением равного объема охлажденного изопропилового спирта с последующим центрифугированием при 10000 об/мин в течение 5 мин. Субнатант сливали. Осадок промывали 80% этанолом. Очищенную ДНК подсушивали при комнатной температуре. Выделенную ДНК каждого проростка растворяли в 100 мкл стерильной воды.

Для каждого анализированного проростка поочередно проводили амплификакцию ДНК по микросателлитным локусам: НА 432, НА 514; НА 1442; ORS 5 при помощи полимеразной цепной реакции. Реакции проводили в 25 мкл стандартной реакционной смеси, содержащей 67 мМ трис HCl рН 8,8; 16,6 мМ сульфата аммония; 3 мМ MgCl₂; 0,01% Tween 20; по 0,2 мМ каждого из dATP, dGTP, dCTP; dTTP; 10 нг ДНК; 1 ед рекомбинантной термостабильной ДНК – полимеразы и 10 пМ праймеров, фланкирующих амплифицируемый локус. Амплификацию проводили в следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 96°С в течение 2 мин, 30 циклов; денатурация при 94°С – 30 сек, обжиг при 60°С в течение 40 сек, элонгация при 70°С в течение 1 мин, финальная элонгация 2 мин.

Продукты амплификации ДНК по заявленным микросателлитным локусам разделяли на фракции известным методом электрофореза в окрашенном агарозном геле. Для этого готовили 2% агарозный гель на ТАЕ буфере, содержащем 0,004М трис-ацетата и 0,002М ЭДТА. В качестве электродного буфера использовали 1 ТАЕ буфер. Для его приготовления к 50 мл однократного ТАЕ буфера добавляли 1 г агарозы, доводили смесь до кипения. Затем охлаждали колбу с горячим гелем под проточной водой до температуры 50-60°С, после этого добавляли 2-3 мкл 1% раствора бромистого этидия. Электрофорез проводили в камере для горизонтального электрофореза в течение 1 ч 30 мин при силе тока 50 мА.

Визуальное сравнение электрофоретических спектров проводили в ультрафиолетовых лучах. Фракции спектров отличаются различной длиной амплифицированных фрагментов ДНК. Длины фрагментов устанавливали при помощи стандартного маркера. Ранее нашими исследованиями была установлена типичная картинка (спектры) амплифицируемого локуса для оцениваемой инбредной линии. Среди оцененных 100 проростков 100 были типичны по локусам НА 514 (см. фиг.2) и НА 1442, один проросток нетипичен по локусу НА 432, два – по локусу ORS 5 (см. фиг.1). Таким образом, 97 проростков имели типичные для линии ВК 678 спектры продуктов амплификации по всем четырем заявленным локусам, т.е. уровень типичности партии семян инбредной линии ВК 678 составил 97%.

Пример №2. Оценка уровня гибридности семян F₁ гибрида подсолнечника Триумф.

Для оценки уровня гибридности партии семян F₁ гибрида Триумф проводили отбор пробы семян, их проращивание, выделение ДНК так же, как в примере №1. Амплификацию ДНК проводили поочередно четырьмя парами праймеров, фланкирующих заявленные локусы, при помощи полимеразной цепной реакции в стандартной реакционной смеси, приведенной в примере №1. Линии ВК 678 и ВК 580, которые являются для гибрида подсолнечника Триумф родительскими, обладают четко различными спектрами продуктов амплификации по локусу НА 1442.

Материнская линия ВК 678 дает аллель А, для отцовской линии ВК 580 характерен аллель В. Кодоминантный тип наследования микросателлитных локусов дает возможность различать среди анализируемых семян гибридные семена, семена со спектром материнской или отцовской формы и семена с нетипичным чужеродным спектром.

Продукты амплификации ДНК по локусу НА 1442, выделенной из проростков, разделяли в геле электрофорезом так же, как в примере №1.

Визуальным сравнением спектров продуктов ПЦР установили, что 87 семян в спектрах амплифицировнной ДНК имели аллель А и аллель В, т.е. оказались гибридными (фиг.3), у 13 проростков спектры продуктов амплификации содержали лишь аллель материнской линии, что указывало на возможность их принадлежности к материнской линии ВК 678.

Таким образом, уровень гибридности семян F₁ партии гибрида Триумф составил 87%, возможный уровень примеси материнской формы 13%.

Итак, заявленный набор микросателлитных локусов с использованием фланкирующих их праймеров расширяет арсенал локусов, рекомендуемых для оценки типичности инбредных линий и уровня гибридности семян F₁ подсолнечника, т.е. достижение поставленной цели. Кроме того, использование, в частности, агарозного геля, а для его окрашивания – бромистого этидия позволяет получить снижение канцерогенности геля и упрощение его окрашивания, т.е. достижение и дополнительной цели изобретения. Заявляемый способ позволяет решить поставленную задачу, состоящую в повышении уровня идентификации генотипов, оценки типичности и гибридности семян F₁ подсолнечника, а также эффективности способа.

Формула изобретения

1. Способ оценки типичности инбредных линий и уровня гибридности семян F₁ подсолнечника, включающий отбор пробы, состоящей из 100 штук семян исследуемой партии оных, их проращивание в течение не менее 3 суток, выделение ДНК из каждого проростка, проведение амплификации ДНК по выбранным микросателлитным локусам с использованием фланкирующих их праймеров при помощи полимеразной цепной реакции, разделение продуктов амплификации на фракции методом электрофореза в окрашенном геле, визуальное сравнение электрофоретических спектров и оценка типичности или гибридности пробы по количеству однотипных спектров, отличающийся тем, что амплификацию ДНК проводят по следующему набору микросателлитных локусов с использованием фланкирующих их праймеров:

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что окрашенный гель, используемый для разделения продуктов амплификации на фракции, является агарозным.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют гель, окрашенный бромистым этидием.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что окрашивание геля бромистым этидием осуществляют путем непосредственного добавления последнего в гель.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что визуальное сравнение электрофоретических спектров осуществляют в лучах ультрафиолетового света.

РИСУНКИ