Патент на изобретение №2157385

(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ МИКРОЧИПОВ НА ОСНОВЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и касается способа изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов, иммобилизованных в органических полимерных гелях, получаемых полимеризацией непредельных мономеров. Такие микрочипы могут найти применение в молекулярной биологии и биотехнологии, при секвенировании и картировании ДНК, в генетическом анализе, при детектировании мутаций, в медицине и для других приложений. Описывается способ изготовления микрочипа на основе олигонуклеотидов, иммобилизованных в органическом геле, приготовленном путем сополимеризации непредельных производных олигонуклеотидов с ненасыщенными мономерами, причем водно-солевые растворы, содержащие ненасыщенные мономеры, модифицированные непредельными фрагментами олигонуклеотиды и компонент каталитической системы, индуцирующей полимеризацию, растворимый только в воде, наносят на стеклянную подложку в виде микрокапель и проводят сополимеризацию мономеров погружением сформированной матрицы в не смешивающийся с водой органический растворитель, содержащий растворенный другой компонент каталитической системы. Технический результат – упрощение способа изготовления микрочипов с высокой плотностью элементов матрицы. 5 з.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и касается способа изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов, иммобилизованных в органических полимерных гелях, получаемых полимеризацией непредельных мономеров. Такие микрочипы могут найти применение в молекулярной биологии и биотехнологии, при секвенировании и картировании ДНК, в генетическом анализе, при детектировании мутаций, в медицине и для других приложений.

Известны способы изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов. Эти способы используют либо олигонуклеотидный синтез непосредственно на поверхности матрицы [Fodor S.P.A., Read J.L., Pirrung M.C., Stryer L., Lu. A.T., and Solas D. (1991) Science 251, 767-773], либо иммобилизацию предварительно синтезированных олигонуклеотидов на микроматрице, модифицированной функциональными группами [Timofeev E. N. , Kochetkova S.V., Mirzabekov A.D., and Florentiev V.L. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 3142-3148].

Известен также способ изготовления олигонуклеотидных микрочипов с помощью фотоинициируемой сополимеризации модифицированных непредельными фрагментами олигонуклеотидов с акриламидом и N,N’-метиленбисакриламидом [Василисков В.А., Тимофеев Э.Н., Суржиков С.А., Дробышев А.Л., Шик В.В., Мирзабеков А.Д. (1998) Молекулярная биология. 32, 923-925]. В соответствии с этим способом готовят растворы индивидуальных модифицированных олигонуклеотидов, содержащие также акриламид, N,N’- метиленбисакриламид, солевой буфер, глицерин, тетраметилэтилендиамин и метиленовый синий, где глицерин служит для повышения вязкости раствора, а метиленовый синий является источником радикалов, генерируемых при облучении смеси светом. В качестве модифицированных олигонуклеотидов используют их аллильные производные. Полученные растворы используют при изготовлении микрочипов по следующей методике. Растворы олигонуклеотидов, разделенные физически с помощью перегородок (спейсеров), помещают между двумя стеклами, одно из которых (верхнее) является маской, и под прозрачными окошками маски проводят одновременную фотоинициируемую полимеризацию растворов, расположенных в разных зонах.

Описанный способ изготовления олигонуклеотидных микрочипов имеет следующие недостатки, а именно:
1) необходимость проведения многочисленных циклов полимеризации растворов олигонуклеотидов;
2) сложность обеспечения герметичности зон при использовании многочисленных спейсеров;
3) возможность взаимного загрязнения элементов матрицы;
4) необходимость изготовления масок;
5) способ не обеспечивает изготовление микрочипа с высокой плотностью элементов матрицы.

В основу изобретения положена задача упрощения способа изготовления микрочипов с высокой плотностью элементов матрицы.

Задача решена тем, что изобретением предлагается способ изготовления микрочипа на основе олигонуклеотидов, иммобилизованных в органическом геле, приготовленном путем сополимеризации непредельных производных олигонуклеотидов с ненасыщенными мономерами, причем водно-солевой раствор, содержащий ненасыщенные мономеры, модифицированные непредельными фрагментами олигонуклеотиды и компонент каталитической системы, индуцирующей полимеризацию, растворимый только в воде, наносят на стеклянную подложку в виде микрокапель и проводят сополимеризацию мономеров погружением сформированной матрицы в не смешивающийся с водой органический растворитель, содержащий растворенный другой компонент каталитической системы.

Предпочтительно в качестве одного из ненасыщенных мономеров использовать акриламид.

Олигонуклеотиды, модифицированные непредельными фрагментами, могут содержать одну или несколько групп общей формулы R¹R²C=CR³R⁴, где R¹, R⁴ = H или алкил C₁-С₃, R² = (CH₂)_n-O-Y и R³ = (CH₂)_n-O-Y, n=1-6, X и Y = фосфодиэфирные группы, связывающие непредельные фрагменты с соседними нуклеотидными звеньями или соседними непредельными фрагментами, или одна из групп X или Y представляет собой атом водорода, которые вводят в олигонуклеотид в ходе стандартного фосфорамидитного олигонуклеотидного синтеза с использованием фосфорамидитов общей формулы R⁵R⁶C=CR⁷R⁸, где R⁵,R⁸ = H или алкил C₁-C₃, R⁶ = (CH₂)_n-O-Р(OCH₂CH₂CN)(N(С₃H₇)₂)₂, n= 1-6, R⁷ = -(CH₂)_n-O-DMT, n=1-6 (DMT = 4,4′-диметокситритил).

Желательно в качестве инициатора полимеризации использовать систему персульфат аммония – тетраметилэтилендиамин (TEMED), в которой персульфат аммония является компонентом, растворимым только в воде, а TEMED растворим и в воде и в не смешивающемся с водой органическом растворителе.

Целесообразно в качестве органического растворителя использовать гексан.

Предпочтительно для нанесения раствора в виде микрокапель использовать струйное подающее устройство, позволяющее с высокой скоростью распределять микрообъемы большого числа растворов по плоской поверхности.

Предлагаемый способ позволяет в одну стадию изготовить микрочип с высокой плотностью элементов матрицы, что необходимо для параллельных манипуляций с тысячами проб нуклеиновых кислот, что дает возможность использовать микрочипы для картирования генома, скрининга клонов, диагностики вирусных и бактериальных инфекций, секвенирования.

Высокая плотность элементов матрицы обеспечивается нанесением растворов в виде микрокапель.

Способ осуществляется следующим образом.

Стекло, используемое в качестве подложки для проведения полимеризации, обрабатывают реагентом, который модифицирует поверхность стекла ненасыщенными группами. Таким реагентом может являться, например, N-[3-(триэтоксисилил)пропил] акриламид, [3-(триэтоксисилил)пропил] (мет)акрилат, аллилтриэтоксисилан и другие.

Водно-солевые растворы, содержащие ненасыщенные мономеры, модифицированные непредельными фрагментами олигонуклеотиды, глицерин и персульфат аммония, наносят на подготовленное описанным выше образом стекло в виде микрокапель требуемого размера (определяемого задаваемой плотностью элементов матрицы) с помощью наносящего устройства, такого как, например, микропипетка, пиновый наноситель, струйный принтер и др. с образованием матрицы мономеров заранее заданной топологии. Каждая микрокапля содержит индивидуальный олигонуклеотид с присоединенным к нему непредельным фрагментом, способный к химически индуцированной сополимеризации с другими ненасыщенными мономерами.

Полученную матрицу погружают в органический растворитель, который не смешивается с растворами мономеров и обладает меньшей, чем у воды плотностью (что препятствует смешиванию растворов мономеров) и который содержит TEMED в качестве другого компонента каталитической системы, индуцирующей радикальную сополимеризацию мономеров. В результате диффузии инициатора полимеризации (TEMED) из органического растворителя в микрокапли происходит одновременная полимеризация всех элементов олигонуклеотидной матрицы, в результате чего получают микрочип с заданной топологией матрицы.

Микрочип, изготовленный описанным способом, представляет собой жесткую подложку, например, стекло, на которой расположены олигонуклеотиды, иммобилизованные в гель путем сополимеризации ненасыщенных мономеров (фиг. 1) и образующие матрицу с заданной топологией и плотностью ее элементов.

Изобретение поясняется конкретным примером его выполнения и фигурами, где
на фиг. 1 представлена схема химически индуцируемой иммобилизации олигонуклеотидов,
на фиг. 2 – использование микрочипа для гибридизации.

Пример 1. Способ изготовления микрочипа химически индуцируемой сополимеризацией олигонуклеотидов.

Микрокапли раствора, содержащего 5% смеси акриламид – N,N’- метиленбисакриламид (19:1), 0,1 М натрий фосфатный буфер, pH 7,0, 40% глицерин, 0,05% персульфата аммония, и 0,3 мМ олигонуклеотида, модифицированного непредельными фрагментами, объемом 0,2 микролитра наносят микродозатором на поверхность стекла. Стекло предварительно обрабатывают [(3-триэтоксисилил)пропил] метакрилатом. Сформированную матрицу растворов погружают в 80 мл 0,5% раствора TEMED в гексане. Полимеризация обычно занимает 1 час при комнатной температуре. Полученный микрочип отмывают водой в течение 1 часа при 60^oC и высушивают. Контроль иммобилизации осуществляют, наблюдая связывание комплементарного флюоресцентно меченного олигонуклеотида (фиг. 2).

Формула изобретения

1. Способ изготовления микрочипа на основе олигонуклеотидов, иммобилизованных в органическом геле, приготовленном путем сополимеризации непредельных производных олигонуклеотидов с ненасыщенными мономерами, отличающийся тем, что водно-солевые растворы, содержащие ненасыщенные мономеры, модифицированные непредельными фрагментами олигонуклеотиды и компонент каталитической системы, индуцирующей полимеризацию, растворимый только в воде, наносят на стеклянную подложку в виде микрокапель и проводят сополимеризацию мономеров погружением сформированной матрицы в несмешивающийся с водой органический растворитель, содержащий растворенный другой компонент каталитической системы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве одного из ненасыщенных мономеров используют акриламид.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве инициатора полимеризации, растворимого и в воде, и в органическом растворителе, используют тетраметилэтилендиамин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют гексан.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве одного из компонентов раствора, наносимого в виде микрокапли, используют глицерин.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что олигонуклеотиды, модифицированные непредельными фрагментами, содержат одну или несколько групп общей формулы
R¹R²С=СR³R⁴,
где R¹, R⁴ = Н или алкил С₁-С₃;
R² = (СН₂)_n-О-Х;
R³ = (СН₂)_n-О-Y, n = 1 – 6, Х и Y = фосфодиэфирные группы, связывающие непредельные фрагменты с соседними нуклеотидными звеньями или соседними непредельными фрагментами, или одна из групп Х или Y представляет собой атом водорода, которые вводят в олигонуклеотид в ходе стандартного фосфорамидитного олигонуклеотидного с использованием фосфорамидитов общей формулы
R⁵R⁶С = СR⁷R⁸,
где R⁵, R⁸ = Н или алкил С₁-С₃;
R⁶ = (СН₂)_n-О-Р(ОСН₂СН₂СN)(N(С₃Н₇)₂)₂, n = 1 – 6;
R⁷ = -(СН₂)_n-О-DMT, n = 1 – 6, DMT-4,4′-диметокситритил.

РИСУНКИ

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 31-2002

(73) Патентообладатель:

ООО “БИОЧИП-ИМБ” (RU)

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 26.09.2002 № 15160

Извещение опубликовано: 10.11.2002

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 20.07.2004

Извещение опубликовано: 10.12.2005 БИ: 34/2005

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 27.03.2006 БИ: 09/2006

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:

Общество с ограниченной ответственностью “БИОЧИП-ИМБ”

(73) Патентообладатель:

Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 08.04.2008 № РД0034855

Извещение опубликовано: 20.05.2008 БИ: 14/2008