Патент на изобретение №2293330

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано для определения уровня антителообразования в организме животных. Сущность включает добавление к лимфоцитам, выделенным из крови рогатого скота. При этом добавляют 1,0-3,0% раствор лимонной кислоты в объемном соотношении 5-10:1, отмывают 0,2М фосфатным буфером с рН 7,2, инкубируют с в 5-15% раствором сыворотки лошади в среде RPMI-1640 при 4°С, фиксацию лимфоцитов проводят до добавления антигена, а в качестве антигена используют моноклональные антитела к иммуноглобулину М рогатого скота. Моноклональные антитела к иммуноглобулину М рогатого скота используют в разведении 1:10000-20000. Использование способа позволяет повысить точность определения антител, дает возможность определить цитоплазматические и мембранные иммуноглобулины лимфоцитов животных, а также уровень антителообразования в организме животных. 1 з.п. ф-лы.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”1988, Jan-Feb., 32(1), p.117-122, реф. Найдено из БД PubMed. PMID: 3276078 [Найдено 16.06.2006]. [он-лайн].

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано для определения уровня антителообразования в организме животных при оценке его иммунного статуса, нарушений клеточного иммунитета, изучения воздействия вакцинных и иммунотропных препаратов на иммунокомпетентные клетки.

Известен способ определения антител путем добавления к лимфоцитам специфического антигена, инкубированием, фиксацией лимфоцитов и регистрацией реакции с помощью иммуноферментной метки (Патент РФ № 2021616, МКИ⁵ G 01 N 33/535, БИ № 19, 1994).

Однако известный способ не позволяет определить изотип исследуемых антител.

Задачей заявленного технического решения является повышение точности способа при определении антителообразования в организме животного.

Поставленная задача решается в способе определения антител путем добавления к лимфоцитам специфического антигена, инкубированием, фиксацией лимфоцитов и регистрацией реакции с помощью иммуноферментной метки тем, что к лимфоцитам добавляют 1,0-3,0% раствор лимонной кислоты в объемном соотношении 1:5-10, инкубирование осуществляют в 5-15% растворе сыворотки лошади в среде RPMI-1640, фиксацию лимфоцитов проводят до добавления специфического антигена, а в качестве специфического антигена используют антитела к иммуноглобулину М. Также поставленная задача решается в способе определения антител тем, что специфический антиген используют в разведении 1:10000-20000.

Иммуноглобулин М – это изотип иммуноглобулинов, который первым появляется в процессе развития В-лимфоцитов, играя центральную роль в регуляции синтеза антител (Литмен С. и Гуд Р. Иммуноглобулины. М: Мир, 1981, с.471).

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы определения антител аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию “новизны”.

Все режимы способа осуществимы в лабораторных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение “промышленно применимо”.

Впервые предложен способ определения антител, позволяющий определить цитоплазматические и мембранные иммуноглобулины лимфоцитов животных (заявленные режимы добавления лимонной кислоты к лимфоцитам, инкубация с сывороткой лошади при 4°С и использование в качестве специфического антигена антител к иммуноглобулину М), как нами установлено, позволяют достичь максимально точного результата определения антител. Также по соотношению цитоплазматических (Ц-Ig) и мембранных (M-Ig) иммуноглобулинов можно определить уровень антителообразования в организме животных. Если это отношение больше 1,0 – это является показателем начальной стадии антигенного раздражения, так как IgM являются “ранними” антителами иммунного ответа на сложные по составу патогенные микроорганизмы (Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М. Мир, 2000, с.100).

Способ иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. Лимфоциты выделяли из свежевзятой крови крупного рогатого скота (КРС). Далее обработку их проводили следующим образом:

а) Пипеткой с тонким наконечником отбирали взвесь лимфоцитов (1-2×10⁶ кл/мл) и разбавляли клеточную суспензию средой RPMI-1640 до 200 мкл. Затем добавляли 40 мкл 3%-ного раствора лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 5:1) и отмывали 5 раз в 0,2 М фосфатном буфере (PBS) с рН 7,2. После тщательного отмывания клетки инкубировали с 15% сывороткой лошади в RPMI-1640 в течение 18 часов при 4°С. Отмывали 3 раза в PBS. На следующем этапе 200 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и делали мазок, далее высушивали и фиксировали. Предметное стекло помещали в раствор моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулину М рогатого скота в разведении 1:10000 на PBS. Инкубировали при 37°С 60 мин. Следующим этапом определения антител, как и в известном способе, является проведение иммуноформентного анализа. Для этого предметные стекла отмывали 3 раза в PBS, высушивали и помещали в раствор антител к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированных с пероксидазой хрена (разведение 1:1000). Клетки инкубировали при 37°С в течение 60 мин и отмывали 3 раза в PBS. На 10 мин погружали препараты в раствор АЭК(3-амино-9-этилкарбазол). Затем предметные стекла промывали проточной водой, высушивали, определяя антитела по появлению специфического окрашивания лимфоцитов в коричневый цвет. Клетки, окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами с мембранной формой иммуноглобулинов. Клетки с окрашенной цитоплазмой считали антителообразующими лимфоцитами. Уровень антителообразования в организме животных определяли подсчитыванием не менее 200 клеток по соотношению Ц-Ig/M-Ig IgM-антител, которое составило 0,56. При определении антителообразования в соответствии с известным способом антитела в свежевзятой крови КРС не определялись.

б) Пипеткой с тонким наконечником отбирали взвесь лимфоцитов (1-2×10⁶ кл/мл) и разбавляли клеточную суспензию средой RPMI-1640 до 200 мкл. Затем добавляли 20 мкл 1%-ного раствора лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 10:1) и отмывали 5 раз в 0,2 М фосфатном буфере (PBS) с рН 7,2. После тщательного отмывания клетки инкубировали с 5% сывороткой лошади в RPMI-1640 в течение 18 часов при 4°С. Отмывали 3 раза в PBS. На следующем этапе 200 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и делали мазок, далее высушивали и фиксировали. Предметное стекло помещали в раствор моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулину М рогатого скота в разведении 1:20000 на PBS. Инкубировали при 37°С 60 мин. Следующим этапом определения антител, как и в известном способе, является проведение иммуноферментного анализа. Для этого предметные стекла отмывали 3 раза в PBS, высушивали и помещали в раствор антител к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированных с пероксидазой хрена (разведение 1:1000). Клетки инкубировали при 37°С в течение 60 мин. и отмывали 3 раза в PBS. На 10 мин погружали препараты в раствор АЭК(3-амино-9-этилкарбазол). Затем предметные стекла промывали проточной водой, высушивали, определяя антитела по появлению специфического окрашивания лимфоцитов в коричневый цвет. Клетки, окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами с мембранной формой иммуноглобулинов. Клетки с окрашенной цитоплазмой считали антителообразующими лимфоцитами. Уровень антителообразования в организме животных определяли подсчитыванием не менее 200 клеток по соотношению Ц-Ig/M-Ig IgM-антител, которое составило 0,62. При определении антителообразования в соответствии с известным способом антитела в свежевзятой крови КРС не определялись.

в) Пипеткой с тонким наконечником отбирали взвесь лимфоцитов (1-2×10⁶ кл/мл) и разбавляли клеточную суспензию средой RPMI-1640 до 200 мкл. Затем добавляли 30 мкл 2%-ного раствора лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 7:1) и отмывали 5 раз в 0,2 М фосфатном буфере (PBS) с рН 7,2. После тщательного отмывания клетки инкубировали с 5% сывороткой лошади в RPMI-1640 в течение 18 часов при 4°С. Отмывали 3 раза в PBS. На следующем этапе 200 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и делали мазок, далее высушивали и фиксировали. Предметное стекло помещали в раствор моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулину М рогатого скота в разведении 1:20000 на PBS. Инкубировали при 37°С 60 мин. Следующим этапом определения антител, как и в известном способе, является проведение иммуноферментного анализа. Для этого предметные стекла отмывали 3 раза в PBS, высушивали и помещали в раствор антител к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированных с пероксидазой хрена (разведение 1:1000). Клетки инкубировали при 37°С в течение 60 мин и отмывали 3 раза в PBS. На 10 мин погружали препараты в раствор АЭК(3-амино-9-этилкарбазол). Затем предметные стекла промывали проточной водой, высушивали, определяя антитела по появлению специфического окрашивания лимфоцитов в коричневый цвет. Клетки, окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами с мембранной формой иммуноглобулинов. Клетки с окрашенной цитоплазмой считали антителообразующими лимфоцитами. Уровень антителообразования в организме животных определяли подсчитыванием не менее 200 клеток по соотношению Ц-Ig/M-Ig IgM-антител, которое составило 0,65. При определении антителообразования в соответствии с известным способом антитела в свежевзятой крови КРС не определялись.

Пример 2. Лимфоциты выделяли из свежевзятой крови коз, иммунизированных 3%-й суспензией эритроцитов мышей. Далее обработку лимфоцитов проводили следующим образом:

а) Пипеткой с тонким наконечником отбирали взвесь лимфоцитов (1-2×10⁶ кл/мл) и разбавляли клеточную суспензию средой RPMI-1640 до 200 мкл. Затем добавляли 40 мкл 3%-ного раствора лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 5:1) и отмывали 5 раз в 0,2 М фосфатном буфере (PBS) с рН 7,2. После тщательного отмывания клетки инкубировали с 15% сывороткой лошади в RPMI-1640 в течение 18 часов при 4°С. Отмывали 3 раза в PBS. На следующем этапе 200 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и делали мазок, далее высушивали и фиксировали. Предметное стекло помещали в раствор моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулину М рогатого скота в разведении 1:10000 на PBS. Инкубировали при 37°С 60 мин. Следующим этапом определения антител как и в известном способе является проведение иммуноферментного анализа. Для этого предметные стекла отмывали 3 раза в PBS, высушивали и помещали в раствор антител к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированных с пороксидазой хрена (разведение 1:1000). Клетки инкубировали при 37°С в течение 60 мин и отмывали 3 раза в PBS. На 10 мин погружали препараты в раствор АЭК(3-амино-9-этилкарбазол). Затем предметные стекла промывали проточной водой, высушивали, определяя антитела по появлению специфического окрашивания лимфоцитов в коричневый цвет. Клетки, окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами с мембранной формой иммуноглобулинов. Клетки с окрашенной цитоплазмой считали антителообразующими лимфоцитами. Уровень антителообразования в организме животных определяли подсчитыванием не менее 200 клеток по соотношению Ц-Ig/M-Ig IgM-антител, которое составило 3,42. При определении антителообразования в соответствии с известным способом антитела в свежевзятой крови коз не определялись.

б) Пипеткой с тонким наконечником отбирали взвесь лимфоцитов (1-2×10⁶ кл/мл) и разбавляли клеточную суспензию средой RPMI-1640 до 200 мкл. Затем добавляли 20 мкл 1%-ного раствора лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 10:1) и отмывали 5 раз в 0,2 М фосфатном буфере (PBS) с рН 7,2. После тщательного отмывания клетки инкубировали с 5% сывороткой лошади в RPMI-1640 в течение 18 часов при 4°С. Отмывали 3 раза в PBS. На следующем этапе 200 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и делали мазок, далее высушивали и фиксировали. Предметное стекло помещали в раствор моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулину М рогатого скота в разведении 1:20000 на PBS. Инкубировали при 37°С 60 мин. Следующим этапом определения антител как и в известном способе является проведение иммуноформентного анализа. Для этого предметные стекла отмывали 3 раза в PBS, высушивали и помещали в раствор антител к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированных с пероксидазой хрена (разведение 1:1000). Клетки инкубировали при 37°С в течение 60 мин и отмывали 3 раза в PBS. На 10 мин погружали препараты в раствор АЭК(3-амино-9-этилкарбазол). Затем предметные стекла промывали проточной водой, высушивали, определяя антитела по появлению специфического окрашивания лимфоцитов в коричневый цвет. Клетки, окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами с мембранной формой иммуноглобулинов. Клетки с окрашенной цитоплазмой считали антителообразующими лимфоцитами. Уровень антителообразования в организме животных определяли подсчитыванием не менее 200 клеток по соотношению Ц-Ig/M-Ig IgM-антител, которое составило 3,56. При определении антителообразования в соответствии с известным способом антитела в свежевзятой крови коз не определялись.

в) Пипеткой с тонким наконечником отбирали взвесь лимфоцитов (1-2×10⁶ кл/мл) и разбавляли клеточную суспензию средой RPMI-1640 до 200 мкл. Затем добавляли 30 мкл 2%-ного раствора лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 7:1) и отмывали 5 раз в 0,2 М фосфатном буфере (PBS) с рН 7,2. После тщательного отмывания клетки инкубировали с 5% сывороткой лошади в RPMI-1640 в течение 18 часов при 4°С. Отмывали 3 раза в PBS. На следующем этапе 200 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и делали мазок, далее высушивали и фиксировали. Предметное стекло помещали в раствор моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулину М рогатого скота в разведении 1:20000 на PBS. Инкубировали при 37°С 60 мин. Следующим этапом определения антител, как и в известном способе, является проведение иммуноферментного анализа. Для этого предметные стекла отмывали 3 раза в PBS, высушивали и помещали в раствор антител к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированных с пероксидазой хрена (разведение 1:1000). Клетки инкубировали при 37°С в течение 60 мин и отмывали 3 раза в PBS. На 10 мин погружали препараты в раствор АЭК(3-амино-9-этилкарбазол). Затем предметные стекла промывали проточной водой, высушивали, определяя антитела по появлению специфического окрашивания лимфоцитов в коричневый цвет. Клетки, окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами с мембранной формой иммуноглобулинов. Клетки с окрашенной цитоплазмой считали антителообразующими лимфоцитами. Уровень антителообразования в организме животных определяли подсчитыванием не менее 200 клеток по соотношению Ц-Ig/M-Ig IgM-антител, которое составило 3,48. При определении антителообразования в соответствии с известным способом антитела в свежевзятой крови коз не определялись.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет определить антитела в организме животного, а также уровень антителообразования, что более точно позволяет определить начальную стадию иммунного ответа.

Формула изобретения

1. Способ определения антител путем добавления к лимфоцитам антигена, инкубирования, фиксации лимфоцитов и регистрации реакции с помощью иммуноферментной метки, отличающийся тем, что к лимфоцитам, выделенным из крови рогатого скота, добавляют 1,0-3,0%-ный раствор лимонной кислоты в объемном соотношении 5-10:1, отмывают 0,2М фосфатным буфером с рН 7,2, инкубирование осуществляют в 5-15%-ном растворе сыворотки лошади в среде RPMI-1640 при 4°С, фиксацию лимфоцитов проводят до добавления антигена, а в качестве антигена используют моноклональные антитела к иммуноглобулину М рогатого скота.

2. Способ определения антител по п.1, отличающийся тем, что моноклональные антитела к иммуноглобулину М рогатого скота используют в разведении 1:10000-20000.