Патент на изобретение №2293324

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ДЛЯ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относиться к медицине, а именно к оториноларингологии, и может найти применение при лечении заболеваний верхних дыхательных путей, при диагностике патологических процессов или заболеваний слизистой оболочки полости носа и околоносовых пазух, а также для разработки новых методов исследования биологических жидкостей. Способ получения биологической жидкости для морфологического исследования включает получение из полипной ткани верхних дыхательных путей или слизистой оболочки верхних дыхательных путей жидкого субстрата путем гомогенизации, который затем центрифугируют 15 минут со скоростью 900g, а полученную надосадочную жидкость в объеме 2,0-2,5 мкл наносят на поверхность стекла в виде капли и высушивают ее методом клиновидной или краевой дегидратации до получения структуры твердой фазы. Технический результат: способ позволяет получить биологическую жидкость в нативном, максимально естественном состоянии, пригодную для морфологического исследования методами клиновидной и краевой дегидратации. 2 ил.

Изобретение относиться к медицине, а именно к оториноларингологии, и может найти применение при лечении заболеваний верхних дыхательных путей, при диагностике патологических процессов или заболеваний слизистой оболочки полости носа и околоносовых пазух, а также для разработки новых методов исследования биологических жидкостей.

Известно, что организм человека состоит из устойчивых структур – клеток и высокодинамичных – биологических жидкостей. Эти системы являются взаимодополняющими. Если высокодинамичные структуры могут существовать без клеточных форм, то клеточные структуры не могут существовать без жидкостных сред, так как поступление питательных веществ и выброс продуктов жизнедеятельности клеток осуществляется путем обмена внутриклеточных и внеклеточных жидкостей организма.

Биологический материал организма, а именно биологические жидкости, отделяемое из ран, секреты желез, субстраты или гомогенаты тканей, несет в себе информацию о состоянии внутренней среды и является предметом лабораторных исследований для диагностики различных патологических состояний.

Биологические жидкости представляют наиболее удобный для изучения динамики физиологических и патологических процессов организма объект. Это – сложные полидисперстные неклеточные структуры с неустойчивыми связями входящих в них компонентов: сыворотка крови, лимфа, ликвор, секреты эндокринных и экзокринных желез, внутриклеточная и внеклеточная жидкость.

По составу биологические жидкости являются лиотропными жидкими кристаллами. Это структурно упорядоченные растворы биологических молекул, в том числе – амфифильных, которыми являются липиды. Амфифильными называются молекулы, имеющие в своем составе растворимую в воде ионную и нерастворимую часть, обладающие отчетливыми двулучепреломляющими свойствами кристаллов.

Биологические жидкости играют важную роль в жизнедеятельности организма, выполняя информационную, управленческую и исполнительную функции.

Самые незначительные изменения в процессе жизнедеятельности организма проявляются в изменении структурной упорядоченности лиотропных жидких кристаллов. Элементы биологических жидкостей моментально реагируют изменением своей структуры на любые воздействия внешнего и внутреннего характера, что позволяет следить за течением заболевания в процессе лечения и осуществлять оперативную коррекцию терапевтических программ.

В настоящее время созданы методики, позволяющие анализировать принципиальные связи устойчивых структур организма, например компьютерная томография, ЯМР-томография и другие. Однако технология выявления высокодинамичных связей в жидких средах организма была разработана лишь в последние годы [1]. Методы клиновидной и краевой дегидратации биологических жидкостей дают возможность получения интегрированной информации, заложенной в особенностях морфологической картины твердой фазы биологических жидкостей, так как дегидратированная биологическая жидкость представляет собой тонкую пленку и фактически является тонким «срезом» неклеточной ткани организма.

Изучение динамики патологических процессов, происходящих в тканях организма при заболеваниях уха, горла, носа, с помощью новой диагностической технологии впервые было проведено в отделении оториноларингологии МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского (руководитель отделения – проф. В.Г.Зенгер) и показало возможности использования этой технологии в диагностике заболеваний ЛОР-органов, в том числе на ранних стадиях, а также прогнозировании и исхода патологического процесса, оценки эффективности проводимой терапии [2].

В настоящее время в доступной литературе опубликованы результаты исследования только внеклеточных биологических жидкостей (сыворотка крови, лимфа, ликвор, секреты эндокринных и экзокринных желез). Последние исследовались как традиционными методами, так и с помощью клиновидной и краевой дегидратации.

В то же время особый интерес представляет морфологическое исследование внутриклеточных биологических жидкостей различных тканей организма человека. Это даст возможность получить новую информацию о процессах, происходящих на более высоком – внутриклеточном уровне. При заболеваниях верхних дыхательных путей большой интерес представляет изучение структур твердой фазы внутриклеточной жидкости слизистой оболочки в норме и при патологии. Однако внутри клетки вода находится большей частью в связанном состоянии, поэтому получение внутриклеточной жидкости представляет достаточно сложную практически задачу.

Для исследования химического состава разных по структурно-функциональному назначению тканей организма человека производится их гомогенизация. Известно достаточно много способов гомогенизации тканей. Однако во всех существующих способах гомогенизации используют добавление к гомогенату ткани различных жидкостных сред. Эта необходимость вызвана тем, что в результате гомогенизации, как правило, получается достаточно густая масса, исследование которой затруднительно. В то же время такое разведение нарушает динамику течения физико-химических процессов, происходящих в исследуемой ткани в естественном состоянии.

Известен традиционный гистологический способ подготовки биологического материала для морфологического исследования, включающий получение кусочка ткани во время операции [3]. Затем операционный материал фиксируют в 10% растворе формалина в течение 48 часов. Вырезанные из фиксированного материала кусочки подсушивают на фильтровальной бумаге и помещают в спирты восходящей крепости (50%, 70%, 96% и абсолютный). После обезвоживания в спиртах фиксированные кусочки переносят в смесь спирта с ксилолом на 1-3 часа, затем – в ксилол до просветления (30 минут). Далее материал помещают в расплавленную смесь парафина с хлороформом на 1-3 часа, с последующей заливкой в парафин. После охлаждения из парафина вырезают блоки с заключенным в них объектом исследования. Парафиновые блоки наклеивают на деревянные колодки. После нарезки на микротоме тонкие срезы толщиной 5 мкм наклеивают на предметное стекло. Далее производят окраску препаратов с помощью различных способов с последующим изучением их под световым микроскопом.

Этот способ позволяет получить тканевый материал, пригодный для морфологического исследования, однако этот материал не является биологической жидкостью. Материал представляет собой окрашенный срез ткани, который не отражает динамики естественных процессов, протекающих в ней в нативном виде. На таком срезе можно изучить только клеточную структуру ткани. Поскольку в процессе приготовления материала используют химическую обработку и дегидратацию, то в результате он представляет собой не биологическую жидкость, а является искусственно дегидратированным биологическим субстратом. Вследствие этого невозможно провести исследование структуризации полученного биологического материала методами клиновидной и краевой дегидратации.

Известен также способ носовой биопсии, включающий получение кусочка ткани нижней носовой раковины для гистологического исследования [4]. Биологический материал берут с помощью щипцов Gerritsma и заливают в гистологическую систему Ткань – Технология II О.С.Т и немедленно замораживают.

Недостатком данного способа является то, что после обработки тканевого материала в гистологической системе невозможно исследовать тканевую биологическую жидкость вследствие нарушения физиологических взаимосвязей последней. Полученный данным способом тканевый биологический материал пригоден для морфологического исследования, но только его клеточного состава, без динамики физиологических и патофизиологических процессов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому способу является способ получения субстрата гиалуроновой кислоты, включающий преобразование тканевого материала в биологическую жидкость [5]. Пупочные канатики, собранные в 0,5% растворе карболовой кислоты, отмывают дистиллированной водой, пропускают через мясорубку, взвешивают и заливают полуторным объемом дистиллированной воды. Смесь встряхивают, отжимают и помещают на 1 минуту в кипящую воду, количественно соответствующую первоначальному весу измельченных канатиков. После кипячения производят фильтрование через двойной слой марли.

Данный способ позволяет получить из биологической ткани жидкий субстрат для исследования. Однако добавление полутора объемов дистиллированной воды и кипячение биологической жидкости исключают последующее исследование ее структуризации. Причем добавление воды нарушает динамику течения естественных физико-химических процессов, а кипячение приводит к денатурации белков, определяющих специфику структуризации.

Из вышесказанного ясно, что разработка новых способов получения внутриклеточной биологической жидкости для последующего исследования представляет в настоящее время несомненную актуальность.

Самым перспективным направлением современной лабораторной диагностики считается изучение феноменов, происходящих при высушивании (драинге) биологических жидкостей. Комплексный системный подход к изучению этого процесса с позицией физико-химии, кристаллографии и принципов синергетики разработан и описан В.Н.Шабалиным и С.Н. Шатохиной [6].

На основании характера драинга можно объективно судить о химическом составе биологической жидкости (в том числе и о спектре макромолекул), а также об их интегральных поверхностно-активных, сорбционных и осмоактивных свойствах. Теоретической основой к исследованию функциональной морфологии биологических жидкостей явилосьучение о самоорганизации и поведении сложных систем, разработанное школами нобелевского лауреата И.Пригожина и Г. Хакена.

За последнее десятилетие Шабалин В.Н. и Шатохина С.Н. установили, что при переходе в твердую фазу в процессе самоорганизации (дегидратация, замораживание) биологические жидкости структуризируются и приобретают устойчивые морфологические формы. Этими авторами разработана методологическая основа исследования морфологических структур биологических жидкостей, а именно методы клиновидной и краевой дегидратации.

Любые как физиологические, так и патологические процессы, протекающие в живом организме, имеют в своей основе специфические особенности структуры белков и других органических молекул. В процессе самоорганизации при клиновидной или краевой дегидратации биологических жидкостей специфические структуры данных молекул формируют «мозаичные» структуры макроуровня, доступные для визуального анализа. В настоящее время выявлен ряд структурированных маркеров, указывающих на определённый патологический процесс.

Основным достоинством методов клиновидной и краевой дегидратации является получение оригинальных объективных и высокозначимых клинико-диагностических данных, позволяющих выявлять патологические отклонения на самых ранних этапах и контролировать самые небольшие изменения в динамике заболевания, что недоступно другим современным методам исследования. Исключительно важное значение данного научного направления состоит и в том, что оно открывает возможность широкого мониторинга здоровья практически здорового контингента населения и является базой для всеобщей диспансеризации, выявления резервов здоровья человека и принятия, своевременных мер по укреплению и предупреждению истощения этих резервов.

Высокая информативность методов морфологического анализа биологических жидкостей, уникальность получаемых данных, их простота и широкая доступность, экономичность и высокая диагностическая достоверность данных делает их самыми оптимальными для исследования полученной внутриклеточной биологической жидкости.

Технический результат заявляемого решения заключается в разработке способа получения внутриклеточной биологической жидкости в навитивном, максимально естественном состоянии для дальнейшего морфологического исследования ее системной и локальной самоорганизации методами клиновидной и краевой дегидратации.

Этот результат достигается тем, что в способе получения биологической жидкости для морфологического исследования, включающем получение из биологической ткани жидкого субстата путем гомогенизации, согласно изобретению в качестве биологической ткани используют полипную ткань верхних дыхательных путей или слизистую оболочку верхних дыхательных путей, гомогенат которой центрифугируют в течениие 15 минут со скоростью 900g, а полученную надосадочную жидкость в объеме 2,0 – 2,5 мкл наносят на поверхность стекла в виде капли и высушивают ее методом клиновидной или краевой дегидратации до получения структуры твердой фазы.

Наличие отличительных признаков, а именно использование в качестве биологической ткани полипной ткани верхних дыхательных путей или слизистую оболочку верхних дыхательных путей, центрифугирование тканевого гомогената в течение 15 минут со скоростью 900g, нанесение надосадочной жидкости в объеме 2,0-2,5 мкл на поверхность стекла в виде капли и высушивание ее методом клиновидной или краевой дегидратации до получения структуры твердой фазы, свидетельствует о соответствии заявляемого технического решения критерию патентоспособности «новизна».

Нами было обнаружено, что при гомогенизации ткани полипов выделяется достаточное количество жидкости, что связано с особенностью тканевой структуры полипной ткани, содержащей вследствие отека большое количество жидкости.

На основании этой особенности ткани полипов нами разработан способ получения биологической жидкости полипной ткани верхних дыхательных путей для ее дальнейшего исследования методами клиновидной и краевой дегидратации.

Заявляемый способ позволяет получить тканевый гомогенат, который представляет собой смесь клеточных структур и вне- и внутриклеточной биологической жидкости в полном составе всех составляющих ингридиентов, без дополнительной жидкости, а также без кипячения. Это делает возможным произвести анализ наиболее динамичных и неуловимых при получении биологической жидкости другими способами происходящих в ней процессов даже на молекулярном уровне, осуществить исследование структуризации полученной биологической жидкости методами клиновидной и краевой дегидратации.

Предлагаемый нами способ получения именно внутриклеточной биологической жидкости в ее нативном состоянии для морфологического исследования методами клиновидной и краевой дегидратации позволяет в результате проведения исследования:

1. Изучить физиологические и патофизиологические механизмы самоорганизации и кристаллизации таких внутриклеточных биологических жидкостей, как гомогенаты полипозной ткани или слизистой оболочки верхних дыхательных путей (далее ВДП), что дает возможность выявить патогенетические механизмы заболеваний ВДП;

2. Выявить типичный для конкретного патологического процесса ВДП структурный морфотип твержой фазы гомогената ткани, что даст возможность разработать новые диагностические критерии для заболеваний верхних дыхательных путей.

3. Произвести объективную оценку прогноза патологического процесса ВДП, его динамики вследствие проводимой терапии, а также оценить эффективность действия применяемых лекарственных препаратов на основании анализа морфологических структур твердой фазы гомогената тканевого биологического материала.

Из вышесказанного следует, что технический результат достигается новой совокупностью существенных признаков, что свидетельствует о соответствии заявляемого технического решения критерию патентоспособности «изобретательский уровень».

Предложение поясняется чертежами, где на фиг.1 представлен увеличенный вид твердой фазы биологической жидкости гомогената полипной ткани, полученный методом клиновидной дегидратации; на фиг.2 представлен увеличенный вид твердой фазы биологической жидкости гомогената ткани носовой раковины, полученный методом клиновидной дегидратации.

Способ осуществляют следующим образом.

Получение биологического материала для исследования производят прямо в операционной. Кусочек удаленной слизистой оболочки ВДП или полипной ткани взвешивают, измельчают и гомогенизируют в гомогенизаторе. Гомогенат помещают в пробирку и центрифугируют в течение 15 минут с частотой 900g. После центрифугирования надосадочную жидкость набирают в лабораторную пипетку и наносят на предметное стекло для исследования в виде капли размером 2,5 мкл. Препарат изучают под микроскопом через 12-72 часов после его приготовления.

Метод клиновидной дегидратации заключается в следующем. Каплю биологической жидкости наносят на обезжиренное предметное стекло, расположенное строго горизонтально. При этом диаметр капли составляет 5-7 мм. Затем каплю высушивают при температуре 20-25°С и относительной влажности 65-70% при минимальной влажности окружающего воздуха. При высыхании капля должна быть неподвижной. Продолжительность периода высыхания (до момента анализа структуры) составляет 12-24 часа.

Клиновидная дегидратация обуславливает особые условия самоорганизации, в результате формируется сухая пленка (фация) со специфическими структурами, представляющими собой индивидуальные биологические параметры. Фация – это структурный макропортрет, отражающий молекулярные взаимоотношения в биологической жидкости, а значит и протекающие в ней патофизиологические процессы.

В этом состоит наибольшая ценность метода клиновидной дегидратации для клинической диагностики. Ни один другой метод лабораторной диагностики не дает информации столь значительного объема и качества.

Метод краевой дегидратации заключается в следующем. Испарение жидкости в капле, находящейся на предметном стекле, происходит из-под так называемой «аналитической ячейки», сформированной наложением на каплю покровного стекла. Испарение происходит через узкую щель между поверхностями стекол, то есть медленно – в течение 48-72 часов.

Если методом клиновидной дегидратации достигается быстрое (12-24 часа) формирование структур, а именно структуризация (системная самоорганизация), то при краевой дегидратации создаются условия для роста отдельных кристаллов, то есть кристаллизация (локальная организация).

Внешний их вид при микроскопии трактуется как текстура или морфотип. Исследования системной и локальной организации дегидратированной капли производят с помощью микроскопии.

Заявляемый способ подтверждается следующими конкретными примерами.

Пример 1. Бурмистров Михаил Владимирович, 45 лет. Диагноз: хронический полипозный риносинусит.

Во время операции 25 октября 2004 года получен кусочек ткани полипа. Затем кусочек ткани взвесили, измельчили и гомогенизировали в гомогенизаторе. Гомогенат поместили в пробирку и центрифугировали в течение 15 минут с частотой 900g. После центрифугирования надосадочную жидкость набрали в лабораторную пипетку и нанесли на предметное стекло в виде капли размером 2,5 мкл для исследования методом клиновидной дегидратации. Препарат изучали под микроскопом через 12 часов после его приготовления.

Вид твердой фазы биологической жидкости гомогената полипной ткани представлен на фиг.1. В исследуемом препарате четко прослеживаются две структурные зоны: центральная (мелкозернистая) и периферическая. Центральная зона представлена солевыми компонентами, а периферическая – белковыми (согласно теории самоорганизации). В периферической зоне присутствуют типичные элементы – аркады.

Таким образом, данный материал пригоден для морфологического исследования структур биологической жидкости.

Пример 2. Кузьмин Н.С., 26 лет. Диагноз: хронический полипозный риносинусит.

Во время операции 20 ноября 2004 года получен кусочек ткани носовой раковины. Затем кусочек ткани взвесили, измельчили и гомогенизировали в гомогенизаторе. Гомогенат поместили в пробирку и центрифугировали в течение 15 минут с частотой 900g. После центрифугирования надосадочную жидкость набрали в лабораторную пипетку и нанесли на предметное стекло в виде капли размером 2,5 мкл для исследования методом клиновидной дегидратации. Препарат изучали под микроскопом через 12 часов после его приготовления.

Вид твердой фазы биологической жидкости гомогената ткани носовой раковины представлен на фиг.2. Исследуемый препарат имеет четкую структурную морфологическую организацию. Видны структурные зоны и структурные компоненты, характерные для морфологической картины биологической жидкости после клиновидной дегидратации.

Таким образом, данный материал пригоден для морфологического исследования структур биологической жидкости.

Способ прошел апробацию в ГУ «Санкт-Петербургский НИИ уха, горла, носа и речи МЗ РФ» в 2004 г.

Из вышесказанного следует, что предлагаемый способ обеспечивает технический результат, не вызывает затруднений, предполагает использование освоенных материалов и стандартного оборудования, что свидетельствует о соответствии заявляемого технического решения критерию патентоспособности «промышленная применимость».

Источники информации

1. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека. / М.: Хризостом, 2001. – С.303.

2. Шатохина С.Н., Зенгер В.Г. Морфология жидких сред организма – новое направление оториноларингологии./ Российская оториноларингология. – М.: 2004, № 5, – С.188-191.

3. Р. Лилли. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. / Издательство «Мир», М.: 1969, – С.645.

4. Н.М. Blom, Т. Godthelp, W.J. Fokkens, A. Klein Jan, A.F. Holmetol. Eurqean Archives of Oto-Rhino-Laryng, 1995 vol. 252 suplement 1. p.33-3912.

5. McClean D., Rogers H., Williams B.W. Early diagnosis of wound infection. / Lancet, 1943, 1, – P.355-361 в модификации Смирнова Л.Г. Получение препарата гиалуроновой кислоты для определения инвазивных свойств микробов. Журнал «Микробиология», 1951, № 10, с.52-56.

6. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека. / М.: Хризостом, 2001. – С.304.

Формула изобретения

Способ получения биологической жидкости для морфологического исследования, включающий получение из биологической ткани жидкого субстрата путем гомогенизации, отличающийся тем, что в качестве биологической ткани используют полипную ткань верхних дыхательных путей или слизистую оболочку верхних дыхательных путей, гомогенат которой центрифугируют в течение 15 мин со скоростью 900 g, а полученную надосадочную жидкость в объеме 2,0-2,5 мкл наносят на поверхность в виде капли и высушивают ее методом клиновидной или краевой дегидратации до получения структуры твердой фазы.

РИСУНКИ