Патент на изобретение №2292906

(54) ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ И КОСМЕТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ПЛАЦЕНТАРНЫЙ ФАКТОР РОСТА PLGF-1

(57) Реферат:

Настоящее изобретение относится к применению фармацевтических и косметических композиций, содержащих плацентарный фактор роста 1 (PLGF-1), и к соответствующим фармацевтическим и косметическим композициям для лечения патологических изменений, в которые вовлечены избыточная продукция и отложение склерозированного коллагена, склеродермии в различных ее проявлениях, старение кожи или выпадение волос. Изобретение отличается тем, что выявлена способность PLGF-1 усиливать ангиогенез в кожной и подкожной соединительной ткани и в соединительной ткани внутренних органов, что уменьшает проявления, вызванные склеротизацией кожи, улучшает тонус и внешний вид кожи. 5 н. и 16 з.п. ф-лы, 1 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”proliferation and release of nitric oxide, cyclic AMP and cyclic GMP in human epithelial cells expressing the FLT-1 receptor. Growth Factors. 2001; 19(3):193-206 [on line] PMID: 11811792 [найдено 27.01.2006]. WO 97/48405 A1 24.12.1997. JP 2001072567 A 21.03.2001. JP 2001316242 A 13.11.2001. WO 01/56593 A2 09.08.2001. lyer S. et al. The crystal structure of human placenta growth factor-1 (P1GF-1), an angiogenic protein, at 2.0 A resolution. J Biol Chem. 2001 Apr 13; 276(15):12153-61. Epub 2000 Nov 7. [on line] PMID: 11069911 [найдено 31.01.2006]. GB 1283892 A 02.08.1972. реферат базы данных Entrez PubMed: Hauser GA. Placental extract injections in the treatment of loss of hair in women. Int J Tissue React. 1982; 4(2):159-63 [on line] PMID:7118177 [найдено 31.01.2006]. RU 2102091 С1 20.01.1998.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к получению терапевтических и косметических композиций, способных усиливать ангиогенез в кожной, подкожной соединительной ткани и в соединительной ткани внутренних органов, содержащих плацентарный фактор роста (PLGF). Поэтому такие композиции пригодны для лечения патологических или естественных состояний, для которых благоприятным будут образование или регенерация новых сосудов кожного отдела, таких как склеродермия в различных ее проявлениях, старение кожи или выпадение волос.

Уровень техники

Плацентарный фактор роста (PLGF) представляет собой гомодимерный гликопротеин, регулирующий ангиогенез. Полная полинуклеотидная последовательность, кодирующая белок PLGF, была описана Maglione и Persico в документе ЕР-В-0 550519 (WO-A-92/06194). При альтернативном сплайсинге РНК PLGF образуются три гомологичные формы, конкретно PLGF-1, PLGF-2 и PLGF-3, имеющие различные полипептидные последовательности, которые все описаны в литературе.

В уровне техники описаны или просто предполагаются области терапевтического применения PLGF-1. В патенте ЕР-В-0550519 предлагается применение PLGF при лечении общих воспалительных состояний, ран, ожогов, язв и послеоперационных состояний. В международной заявке WO-A-01/56593 описано парентеральное системное применение факторов VEGF и PLGF при лечении и предупреждении церебральной, миокардиальной и периферической ишемии. В научной статье, опубликованной Maglione и др. в “II Farmaco”, том 55 (2000), с.165-167, также описано влияние PLGF-1 на предупреждение ишемии миокарда и снижение тяжести инфаркта. В заключение, Faille и др. в статье в “J. Invest. Dermatol.”, том 115 (2), сентябрь 2000, с.388-395 сообщают, что выработка PLGF индуцируется в кератиноцитах, вовлеченных в процессы заживления ранений тканей. Однако из указаний уровня техники невозможно заключить, что PLGF-1 будет эффективным для профилактического или исцеляющего воздействия на заболевания или патологические изменения, в которые вовлечены кожная, подкожная соединительная ткань и соединительная ткань внутренних органов. В частности, из указаний уровня техники невозможно заключить, что местное введение экзогенного PLGF будет эффективно влиять in vivo на кожную васкуляризацию в отношении патологических состояний, а также в обычном состоянии. Эффект стимулирования ангиогенеза и, в частности, стимулирования кожной васкуляризации после введения экзогенного PLGF, который достигается согласно настоящему изобретению, является особенно выгодным при лечении патологических или физиологических состояний, которые склонны к улучшению при более эффективном кровоснабжении.

Раскрытие изобретения

Это изобретение основано на неожиданном открытии того, что повышение содержания PLGF-1 в тканях, образующих кожу, и особенно в соединительной ткани, сопровождается увеличением кожной васкуляризации. Более того, обнаружено, что указанное повышение содержания PLGF-1 в тканях может быть удобно достигнуто путем введения экзогенного PLGF-1, используя парентеральные или местные композиции согласно настоящему изобретению. Оказалось, что стимулирование ангиогенеза является эффективным при лечении типичных патологических состояний кожной, подкожной соединительной ткани и соединительной ткани внутренних органов, таких как склеродермия в ее различных проявлениях локализованной склеродермии, прогрессирующей системной склеродермии и системного склероза, при регенерации поражений кожи и язв, естественного или патологического облысения или обычных физиологических состояний, таких как старение кожи, особенно из-за воздействия солнца или агрессивных агентов атмосферы/окружающей среды.

Объектом настоящего изобретения является применение плацентарного фактора роста плаценты, в частности PLGF первого типа (PLGF-1), для приготовления терапевтических или косметических композиций, стимулирующих ангиогенез при профилактическом или лечебном воздействии на заболевания или естественные или патологические изменения, в которые вовлечены кожная, подкожная соединительная ткань и соединительная ткань внутренних органов и/или сосудистая система.

Конкретно, объектом настоящего изобретения является применение PLGF-1 для приготовления терапевтических композиций для лечения склеродермии, в частности локализованной склеродермии, прогрессирующей системной склеродермии, системного склероза, патологического старения кожи из-за воздействия агрессивных агентов атмосферы/окружающей среды или солнечной радиации и облысения патологического происхождения.

Кроме того, объектом изобретения является применение PLGF-1 в косметике при профилактическом или лечебном воздействии на выпадение волос и старение кожи.

Кроме того, объектом изобретения также являются фармацевтические композиции для местного и парентерального применения, а также косметические композиции для местного применения, включающие в себя PLGF-1 и наполнители, обычные в области фармацевтических и косметических композиций.

Осуществление изобретения

Повышение содержания PLGF-1 в тканях, составляющих кожу, и особенно в кератиноцитах, сопровождается локальным увеличением васкуляризации. Указанное повышение содержания PLGF-1 в тканях может быть достигнуто путем системного, а также местного введения экзогенного PLGF-1.

Анализы

Ангиогенный эффект PLGF-1 определяют известными методами, которые проводятся in vivo или in vitro, такими как анализ васкуляризации роговицы кролика или анализ васкуляризации хорионаллантоисной мембраны цыпленка. Согласно настоящему изобретению кожную васкуляризацию определяют, используя компьютеризированный морфометрический анализ образцов кожи, как описано Streit и др. (см. Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 1999, Dec. 21^st, 96(26), 14888-14893). Срезы кожи, выделенные из лабораторных животных, обработанные согласно настоящему изобретению (или необработанные), окрашивают иммуно-гистохимически, используя моноклональные антитела против CD31 использованного животного. Обработанные таким образом срезы анализируют под электронным микроскопом, причем морфометрический анализ тканей проводят, используя программу IP-LAB (фирма Scanalytics Inc.). Количество кровеносных сосудов на 1 мм², их средние размеры и соответствующую область, занимаемую сосудами, определяют, как описано Streit и др.

У обработанных животных локальная обработка экзогенным PLGF-1 вызывает существенное увеличение изученных параметров васкуляризации, как проиллюстрировано в примерах.

Вторым методом, используемым для оценки ангиогенной активности композиций согласно изобретению, является микроскопическая капилляроскопия и капиллярометрия in vivo. Этот известный подход предусматривает непосредственное микроскопическое обследование кожи, предпочтительно, предварительно обработанной веществами, увеличивающими прозрачность, такими как вазелин или растительные масла.

Предпочтительной зоной анализа является ногтевой валик пальца. Анализ данных, полученных методом капилляроскопии и калиллярометрии, может быть надлежаще проведен с использованием фотографических систем записи и компьютеризированных систем воспроизведения данных. Рассматриваемыми параметрами являются морфология сосудов, морфология периваскулярной ткани и реологический показатель. При морфологическом обследовании регистрируются любое увеличение или уменьшение васкуляризации, просвета капилляров и плотности 1 мм². При обследовании ткани оценивается прозрачность соединительной ткани, наличие кровоизлияния или отложений липидов, или склерозированного коллагена вокруг капиллярных сосудов. В частности, при обследовании периваскулярной соединительной ткани при нормальных условиях выявляется капиллярная петля, окруженная светло-окрашенным ореолом, названным капиллярным ореолом, состоящим из неплотной ткани, обогащенной глюкозаминогликанами. Исчезновение или уменьшение такого ореола является признаком глубокого структурного изменения соединительной ткани. Другими признаками изменения являются пониженная прозрачность ткани, сопровождающая склеродермию. Реологический показатель оценивает скорость кровотока или наличие агрегатов эритроцитов или тромбоза.

Активность композиций изобретения при лечении склеродермии оценивают на животной модели, как описано в статье Yamamoto Т. и др. в Arch.Dermatol. Res. Nov. 2000, 292(11), с.535-541. Состояние склеродермии индуцируют у мышей СЗН путем обработки их блеомицином (100 мкг/мл), который ежедневно вводится под кожу в течение 3 недель. Спустя 3 недели животных умерщвляют, и образцы кожи из зон обработки подвергают гистологическому анализу. На влияние обработки указывают гистологические проявления, которые могут быть приписаны склеротизации кожи, вызванной блеомицином, и, в частности, уплотнение кожи и высокое содержание гидроксипролина.

PLGF

Используемый в настоящем изобретении плацентарный фактор роста первого типа PLGF-1 может быть экстракционного происхождения и может быть получен как продукт экспрессии из генетически модифицированных клеток-хозяев. Способы экспрессии PLGF-1 в клетках-хозяевах известны из уровня техники (см. Maglione and Persico, EP-A-550519 (WO 92/06194)). В предпочтительном варианте воплощения применяется фактор высокой чистоты, по существу, в гомодимерной или мультимерной форме. Способы очистки PLGF-1 также известны (см. статью Ziche et al. Lab. Invest. 1997, 76, 517-531, упомянутую в Отчете о международном поиске, или статью lyer S. et al. J.Biol. Chem., 2001, 276, 12152-12161. В частности, применяется продукт, содержащий не менее чем 98,5% активных димерных и мультимерных форм, не менее чем 70% димерной формы и никак не больше чем 1,5% мономерной формы. Аналогично, в рамках данного изобретения могут быть использованы функционально активные фрагменты PLGF-1. Фрагменты, проявляющие, по меньшей мере, 30% от удельной активности очищенного фактора или, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, или лучше, по меньшей мере, 90% от указанной активности, можно считать функционально эквивалентными природному фактору.

Заболевания

Лечение склеродермии представляет собой один аспект этого изобретения, соответствующий композициям изобретения.

Склеродермия представляет собой заболевание, в которое вовлечены микрососудистая система и кожная, подкожная соединительная ткань и соединительная ткань внутренних органов. Это заболевание вызывает активацию фибробластов и избыточную выработку и отложение коллагена в тканях и вокруг сосудов, что дает значительный вклад в формирование фиброза и зон кальцификации, и поэтому в проявление симптомов, индуцированных заболеванием. В частности, при капилляроскопии наблюдаются большие количества склерозированного коллагена, окружающего сосуды кожи, что вызывает сужение просвета сосудов.

Различают локализованную склеродермию с вовлечением кожи, характеризующуюся затвердением и утолщением кожи из-за избыточного и не соответствующего отложения коллагена, и прогрессирующую системную склеродермию, в которой вовлечение кровеносных сосудов и системный склероз с поражениями внутренних органов ассоциированы с фиброзом кожи. Кожа и, прежде всего, на пальцах и руках, становится твердой, утолщенной и отечной. Кроме того, это заболевание проявляется на уровне миокарда как сердечная недостаточность и на уровне легочной, желудочно-кишечной, почечной и костно-мышечной систем. Более того, у некоторых пациентов развивается вызванная кожным фиброзом эрозионная артропатия, которая очень сильно ограничивает подвижность суставов.

В отношении других ангиогенных лекарственных препаратов сообщалось, что стимулирование ангиогенеза, в частности стимулирование кожного ангиогенеза, благодаря лечению такими лекарственными препаратами, оказывает благотворное влияние на течение болезни. В частности, при капиляроскопическом анализе in vivo поверхности кожи пациентов, пораженной системным склерозом и обработанной ангиогенными факторами, обнаруживается статистически значимое увеличение васкуляризации как в плотности, так и в среднем диаметре сосудов. Более того, новые сосуды не содержат склерозированного коллагена и поэтому способны улучшать поступление крови в ткани. Это улучшение сопровождается частичной ремиссией патологических проявлений.

Авторы, не желая связывать или ограничивать это изобретение научными теориями, предполагают, что терапевтический эффект, проявляемый PLGF-1 на животной модели, при лечении системного склероза опосредуется через сосудорасширяющее действие, которым сопровождается ангиогенез in vivo. Действительно, было продемонстрировано, что один из эффектов, вызванных PLGF-1, заключается в стимулировании образования оксида азота (NO), который по многочисленным научным данным является важным медиатором расширения кровеносных сосудов.

Механизм действия, предположительно на основе эффекта, производимого PLGF-1 при лечении склеродермии и ее коллатеральных проявлений, оказывается соответствующим существующему терапевтическому лечению этих патологических состояний. Фактически это лечение опирается на комбинированное использование различных лекарственных препаратов, среди которых есть агенты, обладающие сосудистым и, главным образом, сосудорасширяющим действием.

Второй аспект изобретения относится к воздействию на феномен, характерный для старения кожи. Такое воздействие, хотя оно представляется, по существу, косметическим, определяет терапевтические последствия с учетом явлений раннего ухудшения кожной ткани из-за длительного воздействия солнечного излучения (фотостарение), других излучений или других агрессивных агентов атмосферы/окружающей среды.

При электронно-микроскопическом исследовании образцов фотоповрежденной кожи выявляется типичная микрососудистая морфология, характеризующаяся, среди прочих проявлений, наличием патологически расширенных капилляров, покрытых эластином или окруженных плотным аморфным материалом. Кроме того, наблюдается наличие активированных эндотелиальных клеток, несущих повышенное количество цитоплазматических органелл и пиноцитозных пузырьков. Было обнаружено, что стимулирование новой кожной васкуляризации, вызванной введением PLGF-1 согласно настоящему изобретению, создает в естественно, а также в преждевременно состарившейся коже модулирующий эффект на внеклеточный матрикс, ответственный за тонус и толщину кожи. Повышенная капиллярная васкуляризация после длительной локальной обработки композициями изобретения сопровождается увеличением количества фибробластов и образованием нового коллагена с последующим общим улучшением внешнего вида кожи.

Другой аспект изобретения относится к выпадению волос.

Улучшенная кожная васкуляризация сопровождается последующими проявлениями терапевтического, а также косметического значения, т.е. модуляцией роста кожных придатков (волосы и др.), предназначенной для предотвращения выпадения волос и их восстановления.

Анагенная фаза, соответствующая фазе роста волос, сопровождается естественным увеличением капиллярной васкуляризации фолликулов. Ангиогенное воздействие локально введенного PLGF-1 способствует такому увеличению васкуляризации и последующему росту волос. При компьютеризированном морфометрическом анализе срезов кожи вблизи волосяных фолликулов животных, обработанных композициями согласно изобретению, выявляется не только увеличение просвета капилляров и плотности капилляров, и, следовательно, общее увеличение перифолликулярной васкуляризации, но также и увеличение размеров волосяных луковиц и, собственно, диаметра волоса.

Эффект предотвращения выпадения волос или стимуляция их повторного роста находит применение не только в случае естественного выпадения, но также в случае выпадения вследствие соответствующих клинических состояний, таких как облысение, гормональные нарушения, хемотерапия, радиотерапия или введение медикаментов.

В соответствии с изобретением могут быть использованы любые рецептуры, подходящие для системного или местного введения терапевтических агентов. Рецептуры для местного применения используются в области косметических приложений.

В частности, фактор PLGF-1 может вводиться парентерально с системным или локальным действием или местно, на кожу или слизистую оболочку, в основном, с локальным действием. Системный эффект, главным образом, достигается при внутривенном введении, хотя также подходящими являются внутрибрюшинное или внутримышечное введение. Локальное действие достигается при местном или парентеральном, внутримышечном, подкожном и внутрисуставном введении. Аналогично фактор PLGF-1 может быть введен локально путем электротранспорта или ионофореза. Когда желательно замедленное высвобождение, также могут быть использованы подкожные импланты. Оральное введение фактора, хотя оно также возможно, является менее желательным в связи с разрушимостью активного продукта.

Композиции для парентерального, системного или локального применения включают в себя растворы, суспензии, липосомные суспензии, эмульсии вода/масло (В/М) или масло/вода (М/В). Композиции для местного применения включают в себя растворы, лосьоны, суспензии, липосомные суспензии, эмульсии В/М или М/В, гели, мази, кремы, помады и пасты. В предпочтительном варианте воплощения активное вещество вводят в рецептуру в лиофилизированном виде в смеси с подходящими для лиофилизации добавками, готовой к перерастворению с помощью терапевтически приемлемых разбавителей. Эффективными добавками для лиофилизации являются буферные растворы, полисахариды, сахароза, маннит, инозит, полипептиды, аминокислоты и любые другие добавки, которые совместимы с активным веществом. В предпочтительном варианте воплощения активное вещество растворяют в фосфатном буфере (NaH₂PO₄/H₂О – Na₂HPO₄/2H₂О) в таком количестве, чтобы после лиофилизации отношение PLGF-1/фосфат составляло между 1:1 и 1:2. Разбавителями, подходящими для парентерального применения, являются вода, физиологические растворы, растворы сахара, водно-спиртовые растворы, масляные разбавители, полиолы, такие как глицерин, полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль, или любой другой разбавитель, который совместим со способом введения в смысле стерильности, величины рН, ионной силы и вязкости.

В случае эмульсий или суспензий композиция может содержать подходящие поверхностно-активные вещества неионного, амфионного, анионного или катионного типа, которые обычно применяются в рецептурах лекарственных препаратов. Для парентерального системного применения предпочтительными являются гидрофильные эмульсии масло/вода, тогда как для локального или местного применения предпочтительными являются липофильные эмульсии вода/масло.

Кроме того, композиции согласно изобретению могут содержать необязательные добавки, такие как изотонические агенты, подобные сахарам или полиспиртам, буферы, хелатирующие агенты, антиоксиданты, антибактериальные агенты.

Композиции для местного применения включают в себя жидкие формы или полутвердые формы. Жидкие формы включают в себя растворы или лосьоны. Эти формы могут быть водными, водно-спиртовыми, например этанол/вода, или спиртовыми и их получают путем солюбилизации лиофилизированного вещества.

Альтернативно растворы активного вещества могут быть введены в рецептуру в виде геля путем добавления известных загущающих агентов, таких как крахмал, глицерин, полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль, поли(мет)акрилат, изопропиловый спирт, гидроксистеарат.

Другим типом композиций для местного применения являются эмульсии или суспензии в виде помад, паст, кремов. Предпочтительными являются эмульсии В/М, обеспечивающие ускоренную абсорбцию. Примерами липофильных наполнителей являются жидкий парафин, безводный ланолин, белый вазелин, цетиловый спирт, растительные масла, минеральные масла. С выгодой могут быть использованы агенты, повышающие проницаемость кожи и тем самым способствующие поглощению вещества. Примерами таких агентов являются физиологически приемлемые добавки, такие как поливиниловый спирт, полиэтиленгликоль или диметилсульфоксид (ДМСО).

Другими добавками, используемыми в местных композициях, являются изотонические агенты, такие как сахара или полиспирты, буферы, хелатирующие агенты, антиоксиданты, антибактериальные агенты, загустители, диспергирующие агенты.

Аналогично могут быть использованы композиции с замедленным высвобождением для местного или системного применения, которые включают в себя полимеры, такие как полилактат, поли(мет)акрилат, поливинилпирролидон, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, и другие вещества, известные из уровня техники. Кроме того, могут быть использованы композиции с замедленным высвобождением в виде подкожных имплантов, например, на основе полилактата или других биодеградируемых полимеров.

Хотя активное вещество предпочтительно упаковывается в лиофилизированной и поэтому стабильной форме, фармацевтическая композиция, предпочтительно, включает в себя вещества, стабилизирующие PLGF-1 в активных димерной/мультимерной формах. Такие стабилизирующие вещества ингибируют образование межмолекулярных дисульфидных связей и тем самым предотвращают полимеризацию активного вещества. Однако количество стабилизирующего вещества необходимо тщательно дозировать для того, чтобы предотвратить сопутствующее восстановление активного вещества в неактивную мономерную форму. Примерами таких веществ являются цистеин, цистеамин или глютатион в восстановленной форме.

Дозировка

Дозировка зависит от способа введения и типа выбранной рецептуры. При парентеральном ведении дозировка находится в пределах от 1 до 500 мкг/кг в сутки, предпочтительно, от 10 до 200 мкг/кг в сутки. Такие дозировки получаются с фармацевтическими композициями, содержащими в единичной дозе приблизительно от 50 мкг до 30 мг активного вещества, предпочтительно, приблизительно от 500 мкг до 10 мг. Для местного терапевтического применения эффективными оказались дозировки в интервале от 0,1 до 10 мг на 1 г композиции. Местные косметические композиции для лечения старения кожи или выпадения волос, предпочтительно, содержат от 0,01 до 0,09 мг активного вещества на 1 г композиции.

Длительность лечения изменяется в зависимости от патологии или желаемого эффекта. В случае лечения склеродермии прием композиции длится от 1 дня до 12 месяцев в зависимости от тяжести патологии. В случае лечения против естественного или раннего старения кожи прием композиции длится от 1 до 400 дней, предпочтительно, по меньшей мере, в течение 30 дней. Аналогично, в случае лечения для предупреждения потери волос или для стимулирования повторного роста волос прием композиции длится от 1 до 400 дней.

Пример 1. Раствор для парентерального применения

Лиофилизированное вещество (58 мг), содержащее 25 мг чистого PLGF-1 и 33 мг фосфатного буфера (10 мг NaH₂PO₄/Н₂O и 23 мг Na₂HPO₄/2H₂О) и около 125 мл физиологического раствора для парентерального применения, раздельно упаковывают во флаконы, предназначенные для смешения лиофилизированного продукта с разбавителем непосредственно перед использованием. После солюбилизации концентрация активного вещества составляет около 0,2 мг/мл.

Пример 2. Эмульсия В/М для местного применения

Количество лиофилизированного вещества, содержащего 20 мг активного вещества, вводят в 5 мл раствора водного спирта, содержащего 10% этанола и 10% ДМСО. Раствор эмульгируют в стерилизованном растительном масле для нанесения на кожу с применением поверхностно-активного вещества, подходящего для эмульсий В/М, обладающего коэффициентом ГЛБ (гидрофильно-липофильный баланс) меньше 10. Эта эмульсия содержит активное вещество в количестве, равном приблизительно 2 мг/г композиции.

Пример 3. Эмульсия М/В

Количество лиофилизированного вещества, содержащего приблизительно 20 мг активного вещества, солюбилизируют в 5 мл раствора водного спирта, содержащего 30% ДМСО, и эмульгируют вместе с подходящим поверхностно-активным веществом в липофильном растворителе на основе растительного масла. Образовавшаяся эмульсия М/В содержит активное вещество в концентрации приблизительно 3 мг/г композиции.

Пример 4. Местная композиция в форме геля

Количество лиофилизированного вещества, содержащего 10 мг активного вещества, вводят в 20 мл раствора водного спирта, содержащего 10% этанола и 20% ДМСО. Затем в раствор добавляют смесь полиэтиленгликоля (400-4000) и полипропиленгликоля. Эта композиция содержит активное вещество в количестве, равном 0,2 мг/г. Гель применяется для косметического нанесения.

Пример 5

Ежедневно в течение 20 суток обрабатывают четыре безволосые мыши линии SKH-1 50 микролитрами раствора, описанного в примере 1 (0,2 мг/мл), парентеральным способом, под кожу на заданной поверхности (1 см²) шкуры в спинной области. Другую группу из четырех мышей SKH-1 в течение 30 суток обрабатывают композицией, описанной в примере 2 (2 мг/г), местно. Группу из четырех мышей той же линии обрабатывают только наполнителями для парентерального применения, и другую группу из четырех мышей обрабатывают только наполнителями для местного применения, придерживаясь аналогичного режима введения. Образцы кожи умерщвленных животных обследуют методом компьютеризированного морфометрического анализа, как описано Стрейтом и др. (см. выше). Более подробно, срезы кожи (5 мкм) окрашивают иммуно-гистохимически, используя моноклональные антитела к мышиному CD31. Обработанные таким образом срезы анализируют под электронным микроскопом, причем морфометрический анализ тканей проводят, используя программу IP-LAB (фирма Scanalytics Inc.). Анализируемыми параметрами являются площадь, занимаемая кровеносными сосудами (в % на 1 мм²), и средний размер сосудов (мкм²). Результаты приведены в таблице.

Приведенные в таблице данные показывают статистически значимое увеличение параметров как при парентеральной, так и при местной обработке, хотя это увеличение слабее выражено при местной обработке.

Пример 6

В этом примере используется животная модель, вызванной блеомицином склеродермии, как описано Yamamoto и др. (см. выше).

Первую группу мышей линии С3Н обрабатывают блеомицином (100 мкг/мл), который вводят подкожно ежедневно в течение 3 недель. В других трех группах мышей С3Н обрабатывают так же, как в первой группе, однако в их ежедневные инъекции добавляют PLGF-1 в концентрации 0,1; 1 и 10 мкг/мл, соответственно. После 3 недель обработки животных умерщвляют, отбирают образцы кожи из зон обработки и подвергают их гистологическому анализу. На влияние обработки PLGF-1 в концентрации 1 и 10 мкг/мл, но не 0,1 мкг/мл, указывают значительное уменьшение гистологических проявлений, связанных с вызванной блеомицином склеротизацией кожи. В частности, значительно снижаются уплотнение кожи и содержание гидроксипролина по сравнению с мышами, обработанными только блеомицином.

Пример 7

Тыльную часть кисти руки здоровых взрослых пациентов в возрасте от 50 до 60 лет, которые обычно в значительной степени подвергались воздействию агрессивной окружающей среды и солнечной радиации, обрабатывают путем местного нанесения на кожу композиции в виде геля, описанного в примере 4. Гель наносят в количестве 1 г, что соответствует 0,2 мг активного вещества в день, в течение 60 дней, в летний сезон. Влияние обработки оценивают методами капилляроскопии и капиллярометрии с использованием систем сохранения и компьютеризированного воспроизведения полученных данных. Анализ необработанных поверхностей показывает типичную картину раннего фотостарения, которая характеризуется наличием патологически расширенных капилляров, покрытых эластином или окруженных плотным аморфным материалом.

На макроскопическом уровне обработка приводит к общему улучшению тонуса и внешнего вида кожи.

В частности, капилляроскопический анализ выявляет увеличение капиллярной васкуляризации, что особенно очевидно в перифолликулярных областях волос. Проведенное методом капиллярометрии сравнение перифолликулярных областей поверхностей, обработанных (или не обработанных) рассматриваемой композицией, показывает увеличение числа сосудов на 1 мм² приблизительно на 35,0%. При известности того, что увеличение васкуляризации волосяных фолликулов стимулирует рост волос, приведенные здесь данные доказывают, что местная обработка PLGF-1 не только эффективна против старения кожи, но также способствует росту капилляров/волос.

Формула изобретения

1. Применение плацентарного фактора роста типа 1 (PLGF-1) для приготовления лекарственного средства, стимулирующего ангиогенез, для профилактического или лечебного воздействия на: заболевания или патологические изменения, в которые вовлечены избыточная продукция и отложение склерозированного коллагена в кожной или подкожной соединительной ткани, или склеродермию, или раннее старение кожи из-за воздействия агрессивных агентов атмосферы или продолжительного действия солнечной радиации.

2. Применение по п.1, в котором заболевание представляет собой локализованную склеродермию или прогрессирующую системную склеродермию.

3. Применение по п.2, в котором локализованная склеродермия является кожной и прогрессирующая системная склеродермия представляет собой миокардиальную склеродермию.

4. Применение по п.1 для приготовления лекарственного средства, стимулирующего ангиогенез, для профилактического или лечебного воздействия на патологическое выпадение волос вследствие облысения, гормональных нарушений, химиотерапии, радиотерапии или введения медикаментов.

5. Применение по п.1, в котором лекарственное средство находится в форме, обеспечивающей местный или системный эффект.

6. Применение по п.1, в котором лекарственное средство находится в форме, подходящей для внутривенного, внутримышечного, внутрисуставного, подкожного, местного введения или введения посредством подкожного импланта или ионофореза.

7. Применение по любому из пп.1-6, где PLGF-1 содержится в количестве, подходящем для введения от 1 до 500 мкг на 1 кг массы тела в сутки, предпочтительно, от 10 до 200 мкг на 1 кг массы тела в сутки.

8. Косметическое применение плацентарного фактора роста типа 1 (PLGF-1) в качестве промотора кожного или подкожного ангиогенеза для профилактики и лечения естественного старения кожи.

9. Применение по п.8, в котором PLGF-1 входит в состав рецептуры косметической композиции для местного применения.

10. Применение по п.8, где PLGF-1 содержится в количестве, подходящем для введения от 1 до 500 мкг на 1 кг массы тела в сутки, предпочтительно, от 10 до 200 мкг на 1 кг массы тела в сутки.

11. Косметическое применение плацентарного фактора роста типа 1 (PLGF-1) в качестве промотора перифоликулярного ангиогенеза для профилактики и лечения естественного выпадения волос.

12. Применение по п.11, в котором PLGF-1 входит в состав рецептуры косметической композиции для местного применения.

13. Применение по п.11, где PLGF-1 содержится в количестве, подходящем для введения от 1 до 500 мкг на 1 кг массы тела в сутки, предпочтительно, от 10 до 200 мкг на 1 кг массы тела в сутки.

14. Фармацевтическая композиция, стимулирующая ангиогенез, содержащая PLGF-1 в качестве активного начала и фармацевтически приемлемый наполнитель, характеризующаяся тем, что, по меньшей мере, 98,5% PLGF-1 находится в активной димерной и мультимерной форме, по меньшей мере, 70% находится в димерной форме и не больше, чем 1,5% находится в мономерной форме и что содержание PLGF-1 составляет от 50 мкг до 30 мг на единичную дозу для парентерального применения и от 0,1 до 10 мг на 1 г композиции для местного применения.

15. Композиция по п.14, характеризующаяся тем, что PLGF-1 представляет собой продукт экспрессии в генетически модифицированных клетках-хозяевах.

16. Композиция по п.14, характеризующаяся тем, что она предназначена для локального или системного применения и находится в форме раствора, лосьона, эмульсии вода/масло, эмульсии масло/вода, суспензии, липосомной суспензии, геля, крема, пасты, мази или подкожного импланта.

17. Композиция по любому из пп.14-16, содержащая одно или несколько веществ, способных стабилизировать PLGF-1 в активных димерных/мультимерных формах.

18. Косметическая композиция, стимулирующая ангиогенез, содержащая PLGF-1 в качестве активного начала и косметически приемлемый наполнитель, характеризующаяся тем, что, по меньшей мере, 98,5% PLGF-1 находится в активной димерной и мультимерной форме, по меньшей мере, 70% находится в димерной форме и не больше, чем 1,5% находится в мономерной форме и что содержание PLGF-1 составляет от 0,01 до 0,09 мг на 1 г композиции.

19. Композиция по п.18, характеризующаяся тем, что PLGF-1 представляет собой продукт экспрессии в генетически модифицированных клетках-хозяевах.

20. Композиция по п.18, характеризующаяся тем, что она предназначена для локального или системного применения и находится в форме раствора, лосьона, эмульсии вода/масло, эмульсии масло/вода, суспензии, липосомной суспензии, геля, крема, пасты, мази или подкожного импланта.

21. Композиция по любому из пп.18-20, содержащая одно или несколько веществ, способных стабилизировать PLGF-1 в активных димерных/мульти-мерных формах.