Патент на изобретение №2292551

(54) СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРИУТРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ У НОВОРОЖДЕННЫХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к ПЦР-диагностике. Раннюю диагностику внутриутробных инфекций у новорожденных осуществляют с помощью ПЦР-диагностики возбудителей перинатальных инфекций в последе. Для этого препарат, пригодный для выявления и ДНК- и РНК-содержащих возбудителей, получают следующим образом. Берут пробы плаценты размерами 1,0×1,0 см в месте разрыва плодных оболочек и в межворсинчатом пространстве в центре последа. Помещают пробы в емкость со стерильным физиологическим раствором, хранят не более 4 часов при +4°C, после этого пробы измельчают, берут 200 мкл и проводят щелочную экстракцию, добавляя к суспензии 200 мкл р-ра, содержащего 1,5 М NaCl, 0,3 М NaOH, 0,1% раствор саркозила, 0,5% додецилсульфата натрия. Пробу оставляют на 16-18 часов при +4°C, затем суспензию встряхивают, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин, полученную суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и осуществляют хлороформно-фенольную экстракцию и денатурацию этанолом. Использование способа позволяет повысить точность выявления конкретных возбудителей внутриутробных инфекций.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”инфекции у новорожденных с церебральными поражениями. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1999, N6, с.74-76. MILEWSKA-BOBULA В. Congenital cytomegalovirus infection – clinical characteristics including prenatal diagnosis. Med Wieku Rozwoj. 2003, 7 (3, Suppl 1), p.123-127, PMID: 15537252, реф., [он-лайн], [найдено 11.05.2006], найдено из базы данных PubMed.

Изобретение относится к медицине, точнее к лабораторной диагностике внутриутробных инфекций у новорожденных.

В настоящее время известен способ прогнозирования риска развития внутриутробной инфекции у новорожденного, включающий определение воспалительно-дистрофических изменений гистологическими методами во всех частях последа: в различных участках плаценты, ворсинках и межворсинчатом пространстве, в оболочках последа, в плаценте и ее сосудах, в центре плаценты, на периферии, на материнской и плодной поверхностях (RU №2168946). По сочетанию выявленных воспалительно-дистрофических изменений в различных структурных частях последа прогнозируют степень риска развития внутриутробной инфекции у новорожденных (В.А.Цинзерлинг, В.Ф.Мельникова, 2002),

Известный способ обладает рядом недостатков:

– исследуется большое количество проб из различных участков плаценты;

– выявляются непатогномоничные, неспецифические воспалительно-дистрофические изменения, которые могут вызываться не только различными возбудителями, но и другими причинами, например родовое травматическое повреждение, метаболические расстройства и т.д.;

– оценка воспалительно-дистрофических изменений субъективна;

– гистологическое исследование плаценты занимает 2 от 10 до дней.

Наиболее близким аналогом-прототипом является способ выявления возбудителей инфекций в аутопсийном материале путем постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР), при котором кусочки тканей взвешивают, 100 мг растирают в ступке в жидком азоте до порошка. Затем для выделения РНК порошок переносят в гомогенизатор и следуют инструкции по выделению РНК. Для выделения ДНК к полученному порошку добавляют равный объем (0,1 мл) стерильного физиологического раствора, тщательно перемешивают и отбирают необходимый объем материала согласно инструкции по выделению ДНК (Инструкция фирмы “Интерлабсервис” по забору, транспортировке и предобработке биопсийного и аутопсийного материала, Инструкции к комплектам реагентов по выделению нуклеиновых кислот, Москва, 2004).

Недостатками прототипа являются:

– необходимость разных видов пробоподготовки для выделения ДНК-содержащих и РНК-содержащих вирусов;

– повышенные меры безопасности при работе с жидким азотом;

– взятие определенного количества аутопсийного материала, а именно 100 мг;

– повышение затрат на дополнительное оборудование, связанное с работой с жидким азотом.

Задача изобретения – предложить объективный и быстрый способ прогнозирования риска реализации внутриутробной инфекции у новорожденных.

Техническим результатом является выявление конкретных возбудителей внутриутробных инфекций методом ПЦР в пробах плаценты, взятых в оболочке в месте разрыва и в межворсинчатом пространстве в центре плаценты.

Технический результат достигается следующим образом. Для исследования берут 2 кусочка плаценты размером 1,0×1,0 см в двух местах. Первый – в месте разрыва плодных оболочек, так как это наиболее вероятное место присутствия и размножения возбудителя при восходящем пути проникновения инфекционных агентов в плаценту и плод из нижних отделов генитального тракта. Вторую пробу берут в межворсинчатом пространстве в центре плаценты, где наиболее активный кровоток и наиболее вероятно присутствие возбудителя, попавшего в плаценту и плод гематогенным путем. Затем оба кусочка помещают в емкость со стерильным физиологическим раствором, который покрывает их поверхность. Образцы доставляют в лабораторию в течение 2-4 часов при +4°С и сразу начинают обработку. Хранение проб не допускается, так как при этом увеличиваются потери РНК вследствие деградации. Оба кусочка плаценты переносят из контейнера в ступку, добавляют 1,0 мл культуральной среды, например среды Игла MEM, для того чтобы в случае необходимости часть образца можно было исследовать на культуре ткани или бактериологических средах. Затем кусочки измельчают для того, чтобы успешнее произошел лизис клеток, денатурация белков, нейтрализация и удаление посторонних примесей при последующих этапах пробоподготовки. Недостаточный лизис приводит к тому, что клеточный детрит маскирует специфическую ДНК, уменьшает вероятность ее контакта с ДНК-полимеразой и повышает возможность ложноотрицательных результатов.

Далее 200 мкл измельченной суспензии переносят в пробирку типа Эппендорф и добавляют 200 мкл щелочной смеси следующего состава: 1,5 М NaCl, 0,3 М NaOH, 0,1% раствор саркозила, 0,5% додецилсульфата натрия. Оставляют пробу на 16-18 часов при +4°С. После этого суспензию встряхивают на микроцентрифуге и центрифугируют 5 минут при 5000 об/ мин. 200 мкл супернатанта переносят в пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл.

Затем производят фенольно-хлороформную экстракцию и денатурацию этанолом. В результате получают чистый препарат нуклеиновых кислот, пригодный для ПЦР или от-ПЦР. Измельчение, щелочной лизис и фенольная экстракция позволяют избавиться от примесей в аутопсийном материале, богатом продуктами некроза и аутолиза тканей, распада ядер и клеток, нарушенного обмена протеинов, липидов, ферментов и других ингибиторов ПЦР. Таким образом получают препарат высокой степени очистки, пригодный для эффективного выявления возбудителей.

Полученный препарат используют для выявления возбудителей перинатальных инфекций, как РНК-, так и ДНК-содержащих (например, Enteroviruses, Rubella virus, Herpes simplex virus I, II types, Cytomegalovirus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum, Listeria monocytogenes) путем последующей постановки амплификации и детекции продуктов ПЦР методом горизонтального электрофореза. Далее результат фотографируют и оставляют на хранение в архиве.

Преимущества предлагаемого способа:

– уменьшение количества проб при исследовании: берутся только 2 пробы в местах наиболее вероятного размножения вирусов при восходящем и гематогенном пути проникновения возбудителя в плаценту и плод;

– высокая чистота препарата нуклеиновых кислот, пригодная для постановки ПЦР, достигается удалением и нейтрализацией примесей, которыми богат аутопсийный материал, с помощью размельчения, щелочной обработки, фенольно-хлороформной экстракции и денатурации этанолом;

– сокращение времени исследования до 2-х дней;

– один технически простой способ пробоподготовки для ПЦР используют для выявления комплекса РНК- и ДНК-содержащих возбудителей перинатальных инфекций, при этом уменьшение потерь РНК достигается коротким интервалом времени между забором материала и началом пробоподготовки – не более 4 часов;

– возможность выявления конкретных возбудителей способствует проведению адекватного лечения новорожденного и соответствующей реабилитационной терапии матери.

Пример 1.

Проведено исследование плаценты у женщины М., 30 лет, беременность которой протекала с угрозой выкидыша на 14 неделе на фоне хронического пиелонефрита. Ребенок родился на 36 неделе, с массой тела 2800 г. Взяты для исследования 2 кусочка плаценты, размером 1,0×1,0 см. Один – в месте разрыва плодных оболочек, второй – в межворсинчатом пространстве в центре плаценты. Пробы в тот же день были доставлены в лабораторию и через 2 часа после забора материала подвергнуты обработке. Оба кусочка были измельчены в ступке, предварительно обработанной хромпиком и простерилизованной, с добавлением культуральной среды Игла MEM. К 200 мкл полученной суспензии добавили равный объем щелочной смеси и оставили на 16 часов при +4°C. После этого произвели встряхивание и центрифугирование 5 мин при 5000 об/мин. 200 мкл супернатанта перенесли в пробирку типа Эппендорф объемом 1.5 мл, затем провели фенольно-хлороформную экстракцию, полученный препарат нуклеиновых кислот использовали для проведения амплификации. Выявление РНК-содержащих вирусов (Enteroviruses, Rubella virus) проводили наборами фирмы “Изоген”. Выявление ДНК-содержащих возбудителей (Herpes simplex virus I, II types, Cytomegalovirus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum, Listeria monocytogenes) – наборами фирмы “Литех”. В исследуемой пробе выявлен Cytomegalovirus. Для подтверждения результатов ПЦР пробы исследованы быстрым культуральным методом на культуре тканей ФЭЧ. Выявлен и идентифицирован Cytomegalovirus. При гистологическом исследовании плаценты регистрированы воспалительно-дистрофические изменения: отложения фибриноида на поверхности ворсин, псевдоинфаркты, кальцификаты, диссоциированное созревание ворсин, дистрофические изменения в строме ворсин, в стенках сосудов. По результатам ПЦР-диагностики и гистологического исследования сделан вывод о высоком риске реализации внутриутробной цитомегаловирусной инфекции. У новорожденного были выражены петехии, желтуха, нарушение функции печени. Даны рекомендации о переводе ребенка из роддома в отделение патологии новорожденных с лечением, включающим применение антицитомегаловирусного иммуноглобулина, виферона и другое адекватное лечение.

Пример 2.

Исследованы пробы плаценты у женщины К., 24 лет. Беременность первая, протекала с угрозой выкидыша на 24 неделе и гестационным пиелонефритом. Ребенок родился на 39-40 неделе с массой тела 3140 г. Исследование плаценты методом ПНР проводили, как описано в примере 1. В исследуемой пробе обнаружена Ureaplasma urealyticum. При гистологическом исследовании плаценты выявлены воспалительно-дистрофические изменения: фибриноид, выраженные дистрофические изменения в строме ворсин, в стенках сосудов, фибробластическая реакция. На основании этих данных сделан вывод о высокой степени риска развития внутриутробной уреаплазменной инфекции у ребенка. В периоде новорожденности выявлены: задержка внутриутробного развития по гипотрофическому типу, длительный адаптационный период, перинатальная энцефалопатия, синдром нейромышечной дистонии и вегетовисцеральных нарушений. Рекомендовано лечение антибиотиками группы макролидов, например ровамицином.

Формула изобретения

Способ ранней диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных, состоящий в ПНР-диагностике возбудителей перинатальных инфекций в последе, отличающийся тем, что пробы плаценты размерами 1,0×1,0 см берут в месте разрыва плодных оболочек и в межворсинчатом пространстве в центре последа, помещают в емкость со стерильным физиологическим раствором, хранят не более 4 ч при 4°C, после этого пробы измельчают, берут 200 мкл и проводят щелочную экстракцию, добавляя к суспензии 200 мкл р-ра, содержащего 1,5 М NaCl, 0,3 М NaOH, 0,1%-ный раствор саркозила, 0,5% додецилсульфата натрия, оставляют пробу на 16-18 ч при 4°C, затем суспензию встряхивают, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин, полученную суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и осуществляют хлороформно-фенольную экстракцию и денатурацию этанолом.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 27.09.2007

Извещение опубликовано: 20.05.2009 БИ: 14/2009