Патент на изобретение №2292326

(54) БИОПРЕПАРАТ-НЕФТЕДЕСТРУКТОР

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическому препарату для очистки загрязненной нефтью и нефтепродуктами почвы при одновременном восстановлении ее физико-химических свойств и естественного биоценоза. Биопрепарат-нефтедеструктор включает культуру бактерий и микробное удобрение в виде ферментированного подстилочного птичьего помета, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians. В качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3K с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения. Изобретение позволяет повысить нефтедеструктирующую активность, стимулировать развитие нефтеокисляющей микрофлоры, увеличить скорость разложения нефти, обеспечить интенсификацию микробных процессов, восстанавливающую агрохимические свойства почвы, проводить очистку нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом. 6 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”Спецвыпуск. 2004, с.27-31. МУРЫГИНА В.П. Очистка водной поверхности и грунтов от нефтяных загрязнений биопрепаратом «Родер». Экология и промышленность России. 1999, с.16-19.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическому препарату на основе микробного удобрения (переработки отходов птицеводческих хозяйств) и на основе микроорганизмов – деструкторов (бактерий рода Bacillus), и может быть использовано для очистки загрязненной нефтью и нефтепродуктами почвы при одновременном восстановлении ее физико-химических свойств и естественного биоценоза.

Известно бактеризованное удобрение, включающее гуминосодержащую основу и бактериальную добавку из группы бактерий: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus polymyxa, см. патент Российской Федерации №2186049 по кл. C 05 F 11/08, C 12 N 1/20, опубл. 2002 г. В бактериальной добавке использованы бактерии Bacillus cereus, штамм 138Д в количестве 5,0·10⁶ клеток/г основы.

Известны штаммы бактерий, используемые для очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений, в частности Bacillus sp., см. патенты Российской Федерации №2083667 по кл. C 12 N 1/20, В 09 С 1/10, C 02 F 3/34, опубл. 1997 г., №2115629 по кл. C 02 F 3/34, В 09 С 1/10, C 12 N 1/20, C 12 N 1/26, опубл. 1998 г., №2182529 по кл. В 09 С 1/10, C 02 F 3/34, C 12 N 1/26, опубл. 2002 г., №2204597 по кл. C 12 N 1/20, C 02 F 3/34, В 09 С 1/10, опубл. 2003 г.

Известно биоорганическое удобрение на основе ферментации помета птиц, содержащее ассоциацию микроорганизмов, способных вызвать биодеградацию нефти и стимулировать рост микроорганизмов, см. патент Российской Федерации №2141932, по кл. C 05 F 11/08, опубл. 1999 г.

Известен способ получения биоудобрения, включающее приготовление микробной массы и иммобилизацию биомассы на органическом носителе в виде сухого гранулированного куриного помета, см. патент Российской Федерации №2130005 по кл. C 05 F 11/08, C 12 N 11/02, опубл. 1999 г.

Известен состав для очистки почвы от нефтяных загрязнений, содержащий нефтеокисляющие микроорганизмы и комплексное удобрение, см. патент Российской Федерации №2112610 по кл. В 09 С 1/10, C 02 F 3/34, C 12 N 1/26, опубл. 1998 г.

Все известные биопрепараты обладают низкой деструктирующей способностью.

Данное техническое решение принято ближайшим аналогом настоящего изобретения.

Однако оно обладает недостатками.

Микробное удобрение этого аналога обладает положительными свойствами минеральных и органических удобрений, но нефтедеструктирующая активность клеток микроорганизмов не достаточна для проведения нефтеочистки почвы в районах с коротким тепловым периодом.

В основу настоящего изобретения положено решение технической задачи, позволяющей создать эффективный, простой и экономичный биопрепарат – нефтедеструктор комплексного действия:

– с высокой нефтедеструктирующей активностью,

– с положительными свойствами минеральных и органических удобрений,

– с простым и рентабельным режимом получения,

– с предпочтительной возможностью использования для очистки нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что биопрепарат-нефтедеструктор включает культуру бактерий и микробное удобрение в виде ферментированного подстилочного птичьего помета, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians.

В качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3 К с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

За счет реализации отличительных признаков изобретения /в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы/ достигаются важные новые свойства объекта.

В предложенном техническом решении совместное использование микробного удобрения Омуг, содержащего микроорганизмы – алканотрофы, и обогащенного микроорганизмами – нефтедеструкторами (бактериями штамма Bacillus cereus 3 К), позволяет получить эффективный биопрепарат – нефтедеструктор с высокой нефтедеструктирующей активностью.

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат, в связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Сущность изобретения заключается в следующем.

Биопрепарат-нефтедеструктор включает микробное удобрение Омуг и культуру бактерий штамма Bacillus cereus 3 К, иммобилизованную на него.

Микробное удобрение Омуг выполнено в виде ферментированного подстилочного птичьего помета и содержит нативные микроорганизмы устойчивой ассоциации: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians.

Микробное удобрение Омуг получают в результате аэробной ферментации отходов птицеводческих хозяйств (подстилочного птичьего помета). В ферментированную массу добавляют минеральные удобрения (NPK) массой около 2% от массы перерабатываемого материала. Ферментацию осуществляют аэробными термофильными бактериями. Активация их жизнедеятельности обеспечивается за счет оптимизации влажности исходной смеси (40%-60%), поддержания высокой пористости (20%-30%). Температура обработки смеси поддерживается 55%-70% за счет тепла, выделенного при окислении органического вещества обрабатываемого материала. Аэробная ферментация активизирует рост аэробной микрофлоры.

Культура бактерий штамма Bacillus cereus шт.3 К депонирована в ГНУ ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ, 2003 (дата заполнения 25.11.03). Культура бактерий штамма Bacillus cereus 3 К выделена из техногенной почвы, загрязненной дизельным топливом (г.Санкт-Петербург).

Из техногенной почвы на территории Кировского завода в районе ТЭЦ (г.Санкт-Петербург) были взяты образцы. Выделение проводили посевом (методом серийных разведении) на плотную питательную среду Придхем-Готлиба, в которой единственным источником углерода использована сырая нефть.

Сущность изобретения поясняется примерами.

ПРИМЕР 1.

Биоорганические носители:

– микробное удобрение Омуг (ближайший аналог) в виде ферментированного подстилочного птичьего помета содержит нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians,

– органическое удобрение Пудрет в виде воздушно-сырой массы, полученной путем сушки птичьего помета (влажностью 75%) в ИК-лучах при температуре 80-96 градусов, при среднем составе в расчете на сухое вещество (% масс.): белковый азот – 3,9; в виде мочевой кислоты – 2,9, NH – 0,36-1,2; С – 34, Р – 1,1; сырые протеины – 26-38; клетчатка – 123-14; углеводы – 35-43; безазотистые экстрактивные вещества – 30-37.

Физические и химические характеристики удобрений представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что органическое удобрение Пудрет не способствует утилизации нефти, хотя обладает адсорбционной емкостью почти в 2 раза ниже, чем у микробного удобрения Омуг.

ПРИМЕР 2.

Биоорганические носители:

– микробное удобрение Омуг в виде ферментированного подстилочного птичьего помета содержит нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Mierococcus varians,

– органическое удобрение Пудрет, представляющее воздушно-сырую массу, полученную путем сушки птичьего помета (влажностью 75%) в ИК-лучах при температуре 80-96 градусов, при среднем составе в расчете на сухое вещество (% масс.): белковый азот – 3,9; в виде мочевой кислоты – 2,9, NH – 0,36-1,2; С – 34, Р – 1,1; сырые протеины – 26-38; клетчатка – 123-14; углеводы – 35-43; безазотистые экстрактивные вещества – 30-37.

Численность трофических групп бактерий в носителях определяют методом Коха: посев носителей на питательную среду Придхем-Готлиба. В качестве единственного источника углерода используют нефть – 1%.

Минеральная среда Придхем-Готлиба, г/л: (NH₄)₂ SO₄ – 2,64; К₂HPO₄ – 5,65; КН₂PO₄ – 2,38; MgSO₄·7H₂O – 1,0; CuSO₄ – 0,064; FeSO₄ – 0,01; MnCl₂ – 0,079; ZnSO₄ – 0,015.

Бактерии-аммонификаторы учитывают на сухом питательном агаре (СПА), олигонитрофилы – на среде Эшби.

Результаты представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 очевидно, что в микробном удобрении Омут содержатся микроорганизмы, утилизирующие сырую нефть (титр алканотрофов 10⁶ клеток/г).

ПРИМЕР 3.

Из нефтезагрязненных почв (40 лет загрязнения дизельным топливом) изолируют бактерии Bacillus cereus шт. 3 К., способные расти с сырой нефтью в качестве единственного источника углерода.

Культуры бактерий – аналоги:

– производственная культура Bacillus subtilis шт. 2843,

– производственная культура Rhodococcus erythropolis шт. 1231.

Проводят анализ нефтедеструктирующей активности почвенных бактерий методом флуоресцентной спектроскопии.

Результаты анализа приведены в таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что наибольшая степень деструкции нефти у бактерий штамма Bacillus cereus 3 К.

Примечание:

Контроль – питательная среда Придхем-Готлиба с 1% нефти.

Из таблиц 3 и 1 видно, что степень деструкции нефти у бактерий штамма Bacillus cereus 3 К почти в два раза (1,93) выше, чем у микробного удобрения Омуг (ближайший аналог).

ПРИМЕР 4.

Бактерии штамма Bacillus cereus 3 К наращивают на плотном сухом питательном агаре в течение 3 суток. Создают водную суспензию бактерий штамма Bacillus cereus 3 К с титром 10¹³ клеток/г. На поверхности 1 м распределяют 1 кг воздушно-сухого микробного удобрения Омуг, распрыскивают 100 мл суспензии бактерий штамма Bacillus cereus 3 К с титром 10¹³ клеток/г и получают биопрепарат, содержащий бактерии штамма Bacillus cereus 3 К с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения Омуг.

ПРИМЕР 5.

Закладку полевого эксперимента проводят на опытном нефтезагрязненном участке (г.Усинск) площадью 2000 м², в который вносят минеральное удобрение (N, P, K) и биопрепарат-нефтедеструктор на основе микробного удобрения Омуг (100 г/м²).

Образцы отбирают через месяц и через два после закладки эксперимента.

Содержание углеводородов в образцах определяют весовым методом. Вытяжку углеводородов проводят гексаном. Фракционирование нефти производят после пиролиза сухого остатка, образующегося после выпаривания гексана из вытяжки при t=480°C. Образовавшуюся после пиролиза газовую фазу анализируют на хроматографе ЛХМ-80, модель №5.

Динамика содержания углеводородов в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Омуг представлена в таблице 4.

Из таблицы 4 видно, что в контроле нефть разложилась на 6%-12%, а в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Омуг на 32%-50%.

Примечание:

Контроль – нефтезагрязненная почва.

ПРИМЕР 6.

Закладку полевого эксперимента проводят на опытном нефтезагрязненном участке (г.Усинск) площадью 2000 м², в который вносят минеральное удобрение (N, P, K) и биопрепарат-нефтедеструктор на основе микробного удобрения Омуг (100 г/м²).

Образцы отбирают через месяц после закладки эксперимента.

Численность трофических групп бактерий в нефтезагрязненной почве и в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Омут определяют методом Коха: посев почв на питательную среду Придхем-Готлиба. В качестве единственного источника углерода используют нефть – 1%.

Минеральная среда Придхем-Готлиба, г/л: (NH₄)₂ SO₄ – 2,64; К₂HPO₄ – 5,65; КН₂PO₄ – 2,38; MgSO₄·7H₂O – 1,0; CuSO₄ – 0,064; FeSO₄ – 0,01; MnCl₂ – 0,079; ZnSO₄ – 0,015.

Бактерии-аммонификаторы учитывают на сухом питательном агаре (СПА), олигонитрофилы – на среде Эшби.

Динамика численности бактерий в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Омут представлена в таблице 5.

Из таблицы 5 видно, что в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Омуг численность бактерий увеличилась в среднем на 35% по сравнению с контролем.

Примечание:

Контроль – нефтезагрязненная почва.

ПРИМЕР 7.

Закладку полевого эксперимента проводят на опытном нефтезагрязненном участке (г.Усинск) площадью 2000 м², в который вносят минеральное удобрение (N, P, K) и биопрепарат-нефтедеструктор на основе микробного удобрения Омуг (100 г/м²).

Образцы отбирают через месяц после закладки эксперимента.

Биологическую активность нефтезагрязненной почвы и нефтезагрязненной почвы с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Омуг оценивают по интенсивности выделения ими СО₂.

СО₂ определяют газохроматографическим методом.

Навеску почвы массой 20 г (в расчете на абсолютно сухой вес) помещают в склянки объемом 120 мл, закрывают ватной пробкой и инкубируют во влажной камере при температуре 27°С. Интенсивность выделения СО₂ определяют через 3-е суток. Для этого склянки «промывают» сжатым воздухом в течение 3-х минут и герметически закрывают пластмассовыми крышками с эластичной резиновой прокладкой. Инкубируют 24 часа в термостате при температуре 27°С. После этого медицинским шприцом отбирают пробы газа объемом 0,5 мл и вводят их в приемник газового хроматографа Хром-4, предварительно делают его калибровку. Для хроматографии используют сорбционные колонки из нержавеющей стали длиной 120 см с внутренним диаметром 2 мм, наполненные сорбентом полисорб-1. В качестве газа применяют гелий, который пропускают со скоростью 20 мм/мин. Температура термостата детектора 100°С. Температура камеры и колонок 20-22°С. Выход CO₂ происходит на 48-й секунде, на хроматографе появляется четкий пик, фиксирующий выход CO₂.

Интенсивность выделения CO₂ в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Омуг представлена в таблице 6.

Из таблицы 6 видно, что в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепарагом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Омут СО₂ выделяется в 5 раз больше по сравнению с контролем.

Примечание:

Контроль – нефтезагрязненная почва.

Приведенные примеры подтверждают, что биопрепарат-нефтедеструктор, полученный путем иммобилизации бактерий штамма Bacillus cereus 3 К на микробное удобрение Омуг, является перспективным биологическим препаратом, способным интенсифицировать микробные процессы в почве, и имеет нефтедеструктирующую активность в два раза выше, чем у ближайшего аналога.

Предложенный биопрепарат-нефтедеструктор на основе микробного удобрения Омуг использовался для обработки загрязненных нефтью почв после аварийного разлива нефти в окрестностях г.Усинска, расположенного в Усинско-Колвинском елово-лесотундровом округе в подзоне лесотундры и крайнесеверной тайги Печерско-Уральской подпровинции, наблюдения за динамикой процессов в нефтезагрязненной почве и оценка активизации восстановления почв при введении этого биопрепарата подтверждают его соответствие критерию «промышленная применимость».

Использование эффективного биопрепарата-нефтедеструктора для очистки нефтезагрязненных почв позволяет:

– повысить нефтедеструктирующую активность,

– стимулировать развитие нефтеокисляющей микрофлоры,

– увеличить скорость разложения нефти,

– обеспечить интенсификацию микробных процессов, восстанавливающую агрохимические свойства почвы,

– совместить положительные свойства минеральных и органических удобрений,

– проводить очистку нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом.

Формула изобретения

Биопрепарат-нефтедеструктор, включающий культуру бактерий и микробное удобрение – носитель в виде ферментированного подстилочного птичьего помета, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians, отличающийся тем, что в качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3 К с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения.