Патент на изобретение №2292221

(54) КОМБИНАЦИИ И КОМПОЗИЦИИ, КОТОРЫЕ ОКАЗЫВАЮТ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ФУНКЦИЮ СИСТЕМ VEGF/ РЕЦЕПТОР VEGF И АНГИОПОЭТИН/РЕЦЕПТОР TIE (II), И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биохимии. Сущность его заключается к разработке комбинации соединений, оказывающих воздействие на биологическую активность систем сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), соединение I, оказывающих воздействие на биологическую функцию систем ангиопоэтин/ рецептор TIE, соединение II. Технический результат – повышение эффективности ингибирования васкуляризации и лечения рака. 5 н. и 18 з.п.ф-лы, 6 табл., 6 ил.

Настоящее изобретение относится к комбинации соединений, оказывающих воздействие на биологическую активность систем сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF)/рецептор VEGF (соединение I) и соединений, оказывающих воздействие на биологическую функцию систем ангиопоэтин/рецептор Tie (соединение II), которую можно применять для ингибирования васкуляризации и лечения рака.

Протеиновые лиганды и тирозинкиназные рецепторы, которые специфически регулируют функцию эндотелиальных клеток, играют существенную роль в ангиогенезе, обусловленном как физиологическими причинами, так и заболеванием. Такие системы типа лиганд/рецептор включают представителей семейств сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и ангиопоэтина (Ang) и их рецепторы, т.е. семейство рецепторов VEGF и семейство тирозинкиназных рецепторов (Tie), содержащих сходные с иммуноглобулином и обладающие гомологией с эпидермальным фактором роста домены. Представители двух семейств тирозинкиназных рецепторов экспрессируются в основном в эндотелиальных клетках. Семейство рецепторов VEGF включает Flt1 (VEGF-R1), Flk1/KDR (VEGF-R2) и Flt4 (VEGF-R4). Эти рецепторы распознаются представителями связанных с VEGF факторов роста, при этом лигандами для Fit1 являются VEGF и плацентарный фактор роста (PIGF), в то время как Flk1/KDR связывается с VEGF, VEGF-C и VEGF-D, а лигандами для Flt4 являются VEGF-C и VEGF-D (Nicosia, Am. J. Pathol. 153, 11-16, 1998). Представителями второго семейства тирозинкиназных рецепторов, обладающих специфичностью в отношении эндотелиальных клеток, являются Tie1 и Tie2 (также известный под названием Tek). В то время как Tie1 является орханным рецептором, было выявлено три секретируемых гликопротеиновых лиганда Tie2, а именно Ang1, Ang2 и Ang3/Ang4 (Davis и др., Cell 87, 1167-1169, 1996; Maisonpierre и др.. Science 277, 55-60, 1997; Valenzuella и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1904-1909; патенты US 5521073, 5650490, 5814464).

Важная роль, которую играют VEGF и его рецепторы в процессе развития состудистой системы, была продемонстрирована в опытах по направленной инактивации генов. Даже гетерозиготное нарушение гена VEGF вызывает имеющий фатальное значение дефицит васкуляризации (Carmeliet и др.. Nature 380, 435-439, 1996; Ferrara и др.. Nature 380, 439-442, 1996). Мыши, имеющие гомозиготные нарушения в гене Flt1 или гене Flk1/KDR, погибают в результате возникновения острых повреждений сосудов. Однако существуют различия в фенотипах, заключающиеся в том, что у мышей с “выключенным” геном Flk1/KDR отсутствуют как эндотелиальные клетки, так и развивающаяся гематопоэтическая система (Shalaby и др., Nature 376, 62-66, 1995), в то время как мыши с дефектным геном Flt1 имеют здоровые гематопоэтические клетки-предшественники и эндотелиальные клетки, которые неспособны образовывать функционально способные сосуды (Fong и др., 376, 66-70, 1995). Тот факт, что нарушение гена Flt4, приводит к тому, что его экспрессия, которая в эмбрионе происходит во всем организме, в организме взрослой особи осуществляется только в лимфатических сосудах, свидетельствует о важной роли Flt4 в процессе ремоделирования и превращения первичной сосудистой сети в более крупные кровеносные сосуды на ранней стадии развития сердечно-сосудистой системы (Dumont и др., Science 282, 946-949, 1998). Аналогично тому, как это происходит при экспрессии Flt4 в лимфатических сосудах взрослых особей, сверхэкспрессия VEGF-C в коже трансгенных мышей приводит к эндотелиальной пролиферации и увеличению сосудов лимфатической системы, но не кровеносной системы (Jeltsch и др., Science 276, 1423-1425, 1997). Кроме того, имеются данные о том, что VEGF-C индуцирует неоваскуляризацию, что установлено в опытах по моделированию ангиогенеза в роговице мыши и хориоаллантоиновой мембране эмбрионов цыплят (Сао и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14389-14394, 1998).

Было установлено также, что второй класс тирозинкиназных рецепторов, специфических в отношении эндотелиальных клеток, играет решающую роль в образовании и поддержании целостности сосудистой сети. Мыши, имеющие дефектный ген Tie1, погибают от отека и кровотечения, обусловленных слабой структурной целостностью эндотелиальных клеток микрососудистой сети (Sato и др., Nature 376, 70-74, 1995; Rodewald и Sato, Oncogene 12, 397-404, 1996). Фенотип, обусловленный “выключением” гена Tie2, характеризуется недоразвитыми сосудами, у которых отсутствует разветвляющая сеть и отсутствуют периэндотелиальные поддерживающие клетки (Sato и др., Nature 376, 70-74, 1995; Dumont и др., Genes Dev. 8, 1897-1909, 1994). Направленная инактивация лиганда Ang1 рецептора Tie2, а также сверхэкспрессия ингибирующего лиганда Ang2, приводят к появлению фенотипа, близкого к фенотипу, обусловленному “выключением” Tie2 (Maisonpierre и др., Science 282, 55-60, 1997; Suri и др., Cell 87, 1171-1180). В противоположность этому при трансгенной сверхэкспрессии Angi была выявлена повышенная васкуляризация (Suri и др., Science 282, 468-471, 1998; Thurstonen и др., Science 286, 2511-2514, 1999).

Результаты исследований влияния экспрессии ангиогенного фактора роста на развитие желтого тела (Maisonpierre и др., Science 277, 55-60, 1997; Goede и др., Lab. Invest. 78, 1385-1394, 1998), исследований развития кровеносных сосудов в сетчатке (Alon и др., Nature Med. I, 1024-1028, 1995; Benjamin и др., Development 125, 1591-1598, 1998) и экспериментов по направленному переносу гена и трансгенных экспериментов с использованием Tie2, Ang1 и Ang2 позволили выявить фундаментальную роль системы ангиопоэтин/рецептор Tie в обеспечении взаимодействий между эндотелиальными клетками и окружающими перицитами или клетками гладких мышц. Предполагается, что Ang1, который экспрессируется периэндотелиальными клетками и, по-видимому, конститутивно экспрессируется в организме взрослой особи, стабилизирует уже существующие развитые сосуды. Ang2, который представляет собой встречающийся в естественных условиях антагонист Ang1 и который экспрессируется эндотелиальными клетками в местах разветвления сосудов, по-видимому, опосредует прекращение контактов эндотелиальных и периэндотелиальных клеток, что в сочетании с инициаторами ангиогенеза, такими как VEGF, приводит к ремоделированию сосудов и их разветвлению, а при отсутствии VEGF приводит к регрессу сосудов (Hanahan, Science 277, 48-50, 1997).

При патологических состояниях, связанных с аберрантной неоваскуляризацией, были выявлены повышенные уровни экспрессии ангиогенных факторов роста и их рецепторов. В большинстве твердых опухолей наблюдаются высокие уровни экспрессии VEGF и рецепторы VEGF присутствуют в основном в эндотелиальных клетках сосудов, окружающих злокачественные ткани или проникающих в них (Plate и др.. Cancer Res. 53, 5822-5827, 1993). Воздействие на систему VEGF/рецептор VEGF с помощью антител, нейтрализующих VEGF (Kim и др., Nature 362, 841-844, 1993), осуществляемая с помощью ретровирусов экспрессия доминантных негативных вариантов рецептора VEGF (Millauer и др., Nature 367, 576-579, 1994), рекомбинантных вариантов рецептора, нейтрализующих VEGF (Goldman и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8795-8800, 1998), или небольших молекул – ингибиторов тирозинкиназного рецептора VEGF (Fong и др., Cancer Res. 59, 99-106, 1999; Wedge и др.. Cancer Res. 60, 970-975, 2000; Wood и др.. Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000) или направленный перенос цитотоксических агентов с помощью системы VEGF/рецептор VEGF (Arora и др., Cancer Res. 59, 183-188, 1999; ЕР 0696456А2), приводит к уменьшению роста опухоли и васкуляризации опухоли. Однако, хотя путем воздействия на систему VEGF/рецептор VEGF можно ингибировать многие типы опухолей, некоторые типы опухолей не поддаются такому воздействию (Millauer и др., Cancer Res. 56, 1615-1620, 1996). Человеческие опухоли, а также применяемые в экспериментах ксенотрансплантаты опухолей, содержат большое количество недоразвитых кровеносных сосудов, которые еще не связаны с периэндотелиальными клетками. Доля недоразвитых сосудов составляет до 40% в характеризующейся медленным ростом злокачественной опухоли простаты и 90% в характеризующейся быстрым ростом глиобластоме. В опытах с использованием трансплантата в качестве модели глиобластомы линии С6 при устранении VEGF с помощью понижающей регуляции трансгенной экспрессии VEGF наблюдалась избирательная облитерация недоразвитых сосудов опухоли. Этот результат согласуется с функцией VEGF как фактора выживаемости эндотелиальных клеток. Аналогично этому при “выключении” экспрессии VEGF в результате терапии, основанной на исключении андрогена, приводит к избирательному апоптозу эндотелиальных клеток в сосудах, у которых отсутствует окружение, состоящее из периэндотелиальных клеток. В отличие от этого у той части сосудов, на которую не оказывало влияние устранение VEGF, было выявлено окружение, состоящее из периэндотелиальных клеток (Benjamin и др., J. Clin. Invest. 103, 159-165, 1999).

Обнаружение повышенного уровня экспрессии рецепторов Tie в эндотелии метастатических меланом (Kaipainen и др.. Cancer Res. 54, 6571-6577, 1994), в карциномах молочной железы (Salvén и др., Br. J. Cancer 74, 69-72, 1996) и в ксенотрансплантатах опухолей, растущих в присутствии доминантно-негативных рецепторов VEGF (Millauer и др., Cancer Res. 56, 1615-1620, 1996), а также повышенных уровней экспрессии рецепторов Flt4 в эндотелии лимфатических сосудов, окружающих лимфомы и карциномы молочной железы (Jussila и др., Cancer Res. 58, 1599-1604, 1998), и VEGF-C в образцах различных опухолей человека (Salven и др., Am. J. Pathol. 153, 103-108, 1998), позволяет предположить, что эти обладающие специфичностью в отношении эндотелия факторы роста и рецепторы могут обеспечивать альтернативные пути неоваскуляризации опухоли. Высокие уровни повышающей регуляции экспрессии Ang2 уже на ранних стадиях развития опухолей рассматривались как механизм защиты хозяина от начального объединения уже существующих сосудов при развитии опухоли. В отсутствии VEGF происходит регресс объединенных сосудов, приводящий к некрозу в центральной части опухоли. В отличие от этого обусловленная гипоксией повышающая регуляция экспрессии VEGF в сочетании с повышенной экспрессией Ang2 сохраняет и поддерживает васкуляризацию опухоли и рост опухоли на краях опухоли (Holash и др., Science 284, 1994-1998, 1999; Holash и др., Oncogene 18, 5356-5362, 1999).

Было установлено, что воздействие на функцию рецептора Tie2 с помощью нейтрализующих ангиопоэтин вариантов Tie2, содержащих внеклеточный лигандсвязывающий домен, приводит к ингибированию роста и васкуляризации опухолей, созданных экспериментальным путем (Lin и др., J. dm. Invest. 193, 159-165. 1999; Lin и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8829-8834, 1998; Siemeister и др., Cancer Res. 59, 3185-3191, 1999). Сравнение с воздействиями на опосредуемые специфическим для эндотелия тирозинкиназным рецептором пути метаболизма, которые оказывает паракринная экспрессия соответствующих доменов внеклеточного рецептора в таком же клеточном окружении, свидетельствует о том, что при блокаде системы рецептора VEGF и Tie2 соответственно происходит ингибирование роста опухоли (Siemeister и др., Cancer Res. 59, 3185-3191, 1999).

Известно, что ингибирование системы VEGF/рецептор VEGF, осуществляемое с помощью различных методов, приводит лишь к замедлению роста большинства создаваемых экспериментальным путем опухолей (Millauer и др., Nature 367, 576-579, 1994; Kirn и др., Nature 362, 841-844, 1993; Millauer и др., Cancer Res. 56, 1615-1620, 1996; Goldman и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8795-8800, 1998; Fong и др.. Cancer Res. 59, 99-106, 1999; Wedge и др., Cancer Res. 60, 970-975, 2000; Wood и др., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000; Siemeister и др., Cancer Res. 59, 3185-3191, 1999). Терапевтическая эффективность даже при увеличении терапевтических доз достигает определенного постоянного уровня (выходит на плато) (Kirn и др., Nature 362, 841-844, 1993; Wood и др., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000). Аналогичные результаты были получены при исследовании воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 (Lin и др., J. Clin. Invest. 103, 159-165, 1999; Lin и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8829-8834, 1998; Siemeister и др., Cancer Res. 59, 3185-3191, 1999).

Таким образом, существует необходимость в разработке способов повышения терапевтической эффективности антиангиогенных соединений.

При разработке способов повышения терапевтической эффективности антиангиогенных соединений неожиданно было установлено, что использование комбинации соединения, приводящего к ингибированию систем VEGF/рецептор VEGF, и соединения, влияющего на биологическую функцию систем ангиопоэтин/рецептор Tie, оказывает выраженные противоопухолевые действия. Причина наблюдаемых выраженных противоопухолевых действий может заключаться в том, что влияние на биологическую функцию систем ангиопоэтин/рецептор Tie дестабилизирует взаимодействие эндотелиальных клеток и периэндотелиальных клеток в существующих зрелых сосудах опухоли и тем самым приводит к сенсибилизации эндотелия к соединениям, обладающим активностью в отношении систем VEGF/рецептор VEGF.

На основе этого неожиданного открытия в настоящем изобретении предложена комбинация соединений, оказывающих влияние на функции систем VEGF/рецептор VEGF и систем ангиопоэтин/рецептор Tie, предназначенная для ингибирования васкуляризации и роста опухоли.

Фармацевтическая композиция состоит из двух компонентов: соединение I ингибирует биологическую активность одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF или состоит из цитотоксических агентов, которые направленно переносятся в эндотелий в результате распознавания систем VEGF/рецептор VEGF. Соединение II воздействует на биологическую функцию одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie или состоит из цитотоксических агентов, которые направленно переносятся в эндотелий в результате распознавания систем ангиопоэтин/рецептор Tie. В альтернативном варианте соединение I ингибирует биологическую активность одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF или систем ангиопоэтин/рецептор Tie, а соединение II состоит из цитотоксических агентов, которые направленно переносятся в эндотелий в результате распознавания одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF или систем ангиопоэтин/рецептор Tie.

Направленный перенос или модуляцию биологических активностей систем VEGF/рецептор VEGF и систем ангиопоэтин/рецептор Tie можно осуществлять с помощью

(а) соединений, которые ингибируют активность тирозинкиназного рецептора,

(б) соединений, которые ингибируют связывание лиганда с рецепторами,

(в) соединений, которые ингибируют активацию внутриклеточных путей передачи сигнала рецепторов,

(г) соединений, которые ингибируют или активируют экспрессию лиганда или рецептора системы рецепторов VEGF или Tie,

(д) систем введения, таких как антитела, лиганды, олигонуклеотиды или олигопептиды, обладающие высокой афинностью к связыванию, или липосомы, которые осуществляют направленный перенос цитотоксических агентов или индуцирующих коагуляцию агентов в эндотелий в результате распознавания систем VEGF/рецептор VEGF или систем ангиопоэтин/рецептор Tie,

(е) систем введения, таких как антитела, лиганды, олигонуклеотиды или олигопептиды, обладающие высокой афинностью к связыванию, или липосомы, которые направленно переносятся в эндотелий и индуцируют некроз или апоптоз.

Соединение, входящее в состав композиций по настоящему изобретению, может представлять собой низкомолекулярную субстанцию, такую как олигонуклеотид, олигопептид, рекомбинантный протеин, антитело или включающие его конъюгаты или слитые с ним протеины. Примером ингибитора может служить низкомолекулярная субстанция, которая инактивирует тирозинкиназный рецептор путем связывания с каталитическим сайтом и его оккупации, в результате чего снижается биологическая активность рецептора. В данной области известен целый ряд ингибиторов киназы (фирма Sugen: SU5416, SU6668; Fung и др., Cancer Res. 59, 99-106 (1999); Vajkoczy и др., Proc. Am. Associ. Cancer Res. San Francisco, реферат №3612 (2000); фирма Zeneca: ZD4190, ZD6474; Wedge и др., Cancer Res. 60, 970-975 (2000); фирма Parke-Davis PD0173073, PD0173074; Johnson и др., Proc. Am. Associ. Cancer Res. San Francisco, реферат №3614 (2000); Dimitroff др., Invest. New Drugs 17, 121-135 (1999)). Примером антагониста является рекомбинантный протеин или антитело, которое связывается с лигандом, в результате чего предотвращается активация рецептора лигандом. Другим примером антагониста является антитело, которое связывается с рецептором, в результате чего предотвращается активация рецептора. Примером модулятора экспрессии является антисмысловая РНК или рибозим, которые контролируют экспрессию лиганда или рецептора. Примером направленно переносимого цитотоксического агента является слитый протеин, содержащий лиганд и бактериальный или растительный токсин, такой как эндотоксин A Pseudomonas, дифтерийный токсин или рицин А. Примером направленно переносимого агента, индуцирующего коагуляцию, является конъюгат одноцепочечного антитела и тканевого фактора. Лигандсвязывающие ингибиторы, такие как нейтрализующие антитела, являются известными в данной области и они описаны в документах фирмы Genentech (например, рекомбинантное человеческое моноклональное антитело к VEGF (rhuMAbVEGF)) и у Presta и др., Cancer Res. 57, 4593-4599 (1997). Домены лигандсвязывающего рецептора описаны у Kendall и Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10705-10709 (1993); Goldman и др., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 95 8795-8800 (1998) и у Lin и др., J. Clin. Invest. 100, 2072-2078 (1997). Другие доминантно-негативные рецепторы описаны у Millauer и др., Nature 367, 567-579 (1994). Антитела, блокирующие рецептор, описаны в документах фирмы Imclone (c-plCll, патент US 5874542). Кроме того, известны антагонистические мутанты лигандов (Siemeister и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4625-4629 (1998). Олигонуклеотиды, обладающие высокой афинностью к связыванию с лигандом или рецептором, описаны в документах фирмы NeXstar (NX0244) и у Drolet и др., Nat. Biotech. 14, 1021-1025 (1996). Кроме того, описаны небольшие молекулы и пептиды.

Описаны регуляторы экспрессии, представляющие собой антисмысловые олигонуклеотиды и рибозимы (RPI, Angiozyme, см. RPI Homepage).

Из литературных источников известны примеры систем введения/направленного переноса, представляющие собой слитые протеины или конъюгаты лиганд/антитело-токсин (Arora и др., Cancer Res. 59, 183-188 (1999);

Olson и др., Int. J. Cancer 73, 865-870 (1997)), представляющие собой липосомы, осуществляющие направленный перенос в эндотелиальные клетки (Spragg и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8795-8800 (1997)) и осуществляющие направленный перенос в эндотелиальные клетки и индуцирующие коагуляцию (Ran и др., Cancer Res. 58, 4646-4653 (1998)).

Небольшие молекулы, которые ингибируют активность тирозинкиназного рецептора, представляют собой, например, молекулы общей формулы I

где r обозначает число от 0 до 2, n обозначает число от 0 до 2;

R₃ и R₄ а) каждый независимо друг от друга обозначает (низш.)алкил, б) вместе образуют мостик общей частичной формулы II

II,

где связь осуществляется через два концевых атома углерода и m обозначает число от 0 до 4; или

в) вместе образуют мостик частичной формулы III

где один или два из кольцевых членов T₁, T₂, Т₃, Т₄ обозначают азот, а каждый из остальных обозначает СН, и связь осуществляется через атомы T₁ и Т₄;

G обозначает C₁-С₆алкил, С₂-С₆алкилен или С₂-С₆алкенилен; или С₂-С₆алкилен или С₂-С₆алкенилен, замещенные ацилокси- или гидроксигруппой; -СН₂-O-, -СН₂-S-, -CH₂-NH-, -OH₂-О-СН₂-, -CH₂-S-CH₂-, -CH₂-NH-CH₂-, окса- (-O-), тиа- (-S) или иминогруппу (-NH-),

А, В, D, Е и Т каждый независимо друг от друга обозначает N или СН, при условии, что не более трех из указанных заместителей обозначают N,

Q обозначает (низш.)алкил, (низш.)алкокси или галоген,

R₁ и R₂ каждый независимо друг от друга обозначает Н или (низш.)алкил,

Х обозначает имино-, окса- или тиагруппу;

Y обозначает водород, незамещенный или замещенный арил,

гетероарил или незамещенный или замещенный циклоалкил; и

Z обозначает аминогруппу, моно- или дизамещенную аминогруппу, галоген, алкил, замещенный алкил, гидроксигруппу, этерифицированную с образованием простого или сложного эфира гидроксигруппу, нитро-, циано-, карбоксигруппу, этерифицированную с образованием сложного эфира карбоксигруппу, алканоил, карбамоил, N-моно- или N,N-дизамещенный карбамоил, амидино-, гуанидино-, меркапто-, сульфо-, фенилтио-, фенил(низш.)алкилтио-, алкилфенилтиогруппу, фенилсульфинил, фенил(низш.)алкилсульфинил, алкилфенилсульфинил, фенилсульфонил, фенил(низш.)алкансульфонил или алкилфенилсульфонил, причем, если присутствуют более одного радикала Z (m2), то заместители Z могут быть одинаковыми или различными, и где связи, указанные стрелкой, представляют собой простые или двойные связи; или N-оксид указанного соединения, где один или несколько атомов азота несут атом кислорода, или его соль. Предпочтительной солью является соль органической кислоты, прежде всего сукцинат.

Эти соединения можно предпочтительно применять в качестве соединения I или II в фармацевтической композиции по изобретению.

Соединения, которые прекращают фосфорилирование тирозина или персистентный ангиогенез, соответственно, что приводит к прекращению роста опухоли и распространения опухоли, представляют собой, например, производные антраниловой кислоты общей формулы IV

где А обозначает группу=NR²,

W обозначает атом кислорода, атом серы, два атома водорода или группу=NR⁸,

Z обозначает группу=NR¹⁰ или

=N-, -N(R¹⁰)-(CH₂)_q-, C₁-С₆алкил с прямой или разветвленной цепью или группу

или А, Z и R¹ вместе образуют группу

m, n и о обозначают числа от 0 до 3,

q обозначает число от 1 до 6,

R_a, R_b, R_c, R_d, R_e, R_f каждый независимо друг от друга обозначает водород, C₁-С₄алкил или группу=NR¹⁰ и/или R_a и/или R_b вместе с R_c и/или R_d или R_c вместе с R_e и/или R_f образуют связь, или до двух групп из числа R_a – R_f образуют с R¹ или R² мостик, содержащий до 3 атомов углерода,

Х обозначает группу=NR⁹ или=N-,

Y обозначает группу -(СН₂)р,

р обозначает целое число от 1 до 4,

R¹ обозначает незамещенный или необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена C₁-С₆алкил или C₁-С₆алкил или C₁-С₆алкокси, который необязательно замещен одним или несколькими атомами галогена, или обозначает незамещенный или замещенный арил или гетероарил,

R² обозначает водород или C₁-С₆алкил или вместе с Z или R¹ образует с R_a-R_f мостик, содержащий до 3 кольцевых атомов,

R³ обозначает моноциклический или бициклический арил или гетероарил, который является незамещенным или необязательно замещен одним или несколькими атомами галогена, C₁-С₆алкилом, C₁-С₆алкокси- или гидроксигруппой,

R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ каждый независимо друг от друга обозначают водород, галоген или C₁-С₆алкокси, C₁-С₆алкил или C₁-С₆карбоксиалкил, которые являются незамещенными или необязательно замещены одним или несколькими атомами галогена, или R⁵ и R⁶ вместе образуют группу

R⁸, R⁹ и R¹⁰ каждый независимо друг от друга обозначают водород или C₁-С₆алкил, а также их изомеры и соли.

Эти соединения также можно предпочтительно применять в качестве соединения I или II в фармацевтической композиции по изобретению.

В качестве соединения I или II в фармацевтической композиции по изобретению более предпочтительно применять соединения общей формулы V

где R¹ обозначает группу

где R⁵ обозначает хлор, бром или группу -ОСН₃,

где R⁷ обозначает -СН₃ или хлор,

где R⁸ обозначает -СН₃, фтор, хлор или -CF₃,

где R⁴ обозначает фтор, хлор, бром, -CF₃, -N=C, -СН₃-OCF₃ или -СН₂ОН

где R⁶ обозначает -СН₃ или хлор

R² обозначает пиридил или группу

и R³ обозначает водород или фтор,

а также их изомеры и соли.

Эти соединения обладают такими же свойствами, что и указанные выше соединения формулы IV, и их можно применять для лечения заболеваний, связанных с ангиогенезом.

В состав композиций входят соединения общих формул I, IV и V индивидуально или в сочетании друг с другом.

Указанные выше соединения, входящие в состав комбинаций по изобретению, также подпадают под объем изобретения.

Еще одним примером ингибиторов связывания лигандов являются пептиды и последовательности ДНК, кодирующие такие пептиды, которые применяют для лечения заболеваний, связанных с ангиогенезом. Такие пептиды и последовательности ДНК представлены в SEQ ID No 1-59 в перечне последовательностей. Было установлено, что наибольший интерес представляют последовательности, представленные в SEQ ID No 34 и SEQ ID No 34a.

Таким образом, объектами настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, которые

а) содержат в качестве соединения I один или несколько агентов, которые модулируют биологическую функцию одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF, и содержат в качестве соединения II один или несколько агентов, которые модулируют биологическую функцию одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie,

б) содержат в качестве соединения I один или несколько агентов, которые направленно переносятся в эндотелий с помощью одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF, и содержат в качестве соединения II один или несколько агентов, которые модулируют биологическую функцию одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie,

в) содержат в качестве соединения I один или несколько агентов, которые модулируют биологическую функцию одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF или одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie, и содержат в качестве соединения II один или несколько агентов, которые направленно переносятся в эндотелий,

г) содержат в качестве соединения I один или несколько агентов, которые модулируют биологическую функцию одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF, и содержат в качестве соединения II один или несколько агентов, которые направленно переносятся в эндотелий с помощью одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie,

д) содержат в качестве соединения I один или несколько агентов, которые направленно переносятся в эндотелий с помощью одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF, и содержат в качестве соединения II один или несколько агентов, которые направленно переносятся в эндотелий с помощью одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie,

е) содержат в качестве соединения I один или несколько агентов, которые модулируют биологическую функцию одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF, и содержат в качестве соединения II один или несколько агентов, которые направленно переносятся в эндотелий с помощью одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF,

ж) содержат в качестве соединения I один или несколько агентов, которые модулируют биологическую функцию одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie, и содержат в качестве соединения II один или несколько агентов, которые направленно переносятся в эндотелий с помощью одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie, и

з) содержат один или несколько агентов, которые оказывают воздействие как на функцию одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF, так и на функцию одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie.

При последовательном терапевтическом введении фармацевтические композиции по изобретению можно вводить одновременно или по отдельности.

Композиции по изобретению содержат в качестве соединения I или в качестве соединения II по меньшей мере одно(у) из

а) соединений, которые ингибируют активность тирозинкиназного рецептора,

б) соединений, которые ингибируют связывание лиганда с рецепторами,

в) соединений, которые ингибируют активацию внутриклеточных путей передачи сигнала рецепторов,

г) соединений, которые ингибируют или активируют экспрессию лиганда или рецептора VEGF- или Tie-рецепторной системы,

д) систем введения, таких как антитела, лиганды, обладающие высокой афинностью к связыванию олигонуклеотиды или олигопептиды, или липосомы, обеспечивающие направленный перенос цитотоксических агентов или индуцирующих коагуляцию агентов в эндотелий с помощью распознавания систем VEGF/рецептор VEGF или ангиопоэтин/рецептор Tie,

е) систем введения, таких как антитела, лиганды, обладающие высокой афинностью к связыванию олигонуклеотиды или олигопептиды, или липосомы, которые направленно переносятся в эндотелий и индуцируют некроз или апоптоз.

Указанные композиции также подпадают под объем настоящего изобретения.

Под объем настоящего изобретения подпадают также фармацевтические композиции, которые содержат в качестве соединения I и/или II по меньшей мере одну субстанцию, имеющую последовательность из числа последовательностей, представленных в SEQ ID No 1-59. Наиболее ценными являются фармацевтические композиции, содержащие в качестве соединения I и/или II субстанции, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID No 34a, и указанные в формуле изобретения фармацевтические композиции, содержащие в качестве соединения I и/или II по меньшей мере одну из субстанций sTie2, МАт 4301-42-35, конъюгат scFv-tTF и/или L19 scFv-tTF.

Кроме того, предпочтительными объектами настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие в качестве соединения I и/или II по меньшей мере одну низкомолекулярную субстанцию общей формулы I, общей формулы IV и/или общей формулы V.

Наиболее предпочтительным соединением, которое можно применять в качестве соединения I или II в композиции по изобретению, является бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1 -ил]аммония.

Следовательно объектами настоящего изобретения являются также фармацевтические композиции, которые содержат в качестве соединения I бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил] аммония, sTie2, МАт 4301-42-35, конъюгат scFv-tTF и/или L19 scFv-tTF, а в качестве соединения II содержат бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония, sTie2, МАт 4301-42-35, конъюгат scFv-tTF и/или L19 scFv-tTF при условии, что соединение I не является идентичным соединению II, и наиболее предпочтительными являются фармацевтические композиции, которые содержат в качестве соединения I бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония, а в качестве соединения II содержат sTie2, МАт 4301-42-35, конъюгат scFv-tTF и/или LI 9 scFv-tTF; фармацевтические композиции, которые содержат в качестве соединения I МАт 4301-42-35, а в качестве соединения II содержат sTie2 и/или конъюгат L19 scFv-tTF; фармацевтические композиции, которые содержат в качестве соединения I конъюгат scFv-tTF, а в качестве соединения II содержат sTie2 и/или МАт 4301-42-35; фармацевтические композиции, которые содержат в качестве соединения I конъюгат L19 scFv-tTF, а в качестве соединения II содержат sTie2.

Указанные выше низкомолекулярные соединения, протеины и ДНК, экспрессирующие протеины, можно применять в качестве лекарственного средства индивидуально или в составе композиций для лечения опухолей, различных видов рака, псориаза, артрита, такого как ревматоидный артрит, гемангиомы, ангиофибромы, глазных болезней, таких как диабетическая ретинопатия, неоваскулярная глаукома, заболеваний почек, таких как гломерулонефрит, диабетической нефропатии, злокачественного нефросклероза, тромбического микроангиопатического синдрома, отторжении после трансплантации и гломерулопатии, фиброзных заболеваний, таких как цирроз печени, пролиферативных заболеваний мезангиальных клеток, атеросклероза и повреждений нервных тканей.

Применение комбинации по изобретению при лечении поврежденных нервных тканей позволяет избежать быстрого образования рубцов в области повреждения. Поэтому не происходит образования рубца до соединения аксонов друг с другом. Вследствие этого восстановление нервных связей происходит намного быстрее.

Кроме того, комбинации по изобретению можно применять для подавления образования асцитов у пациентов. Можно подавлять также образование опосредуемых VEGF отеков.

Для применения комбинаций по изобретению в качестве лекарственного средства соединения должны быть включены в состав фармацевтической композиции. Указанная композиция помимо действующего вещества или действующих веществ содержит фармацевтически приемлемые органические или неорганические инертные носители, такие как вода, желатин, гуммиарабик, лактоза, крахмал, стеарат магния, тальк, растительные масла, полиалкиленгликоли и т.д. Фармацевтические композиции могут находиться в твердой форме, такой как таблетки, пилюли, суппозитории, капсулы, или могут находиться в жидкой форме, такой как растворы, суспензии или эмульсии.

При необходимости композиции могут дополнительно содержать добавки, такие как консерванты, стабилизатор, поверхностно-активные вещества или эмульгаторы, соли для изменения осмотического давления и/или буферы.

Такие применения, а также композиции, содержащие действующие вещества, также являются объектом настоящего изобретения.

Для парентерального введения применяют прежде всего растворы или суспензии для инъекции, прежде всего водные растворы действующих веществ в полигидроксиэтоксилированном касторовом масле.

В качестве носителя можно применять такие добавки, как соли желчной кислоты или фосфолипиды животного или растительного происхождения, а также их смеси и липосомы или их ингредиенты.

Для перорального введения применяют прежде всего таблетки, пилюли или капсулы, содержащие тальк и/или углеводные носители или связующие вещества, такие как лактоза, кукурузный или картофельный крахмал. Для перорального введения композиция может находиться также в форме жидкости, такой как сок, необязательно содержащей подслащивающее вещество.

Доза действующего вещества варьируется в зависимости от пути введения действующего вещества, возраста и веса тела пациента, а также от формы и стадии развития болезни.

Суточная доза действующего вещества составляет 0,5-1000 мг, предпочтительно 50-200 мг.

Дозу можно вводить в виде однократной дозы или разделенных доз два или большее количество раз в день.

Указанные композиции и формы введения также подпадают под объем настоящего изобретения.

Комбинированное (объединенное) функциональное воздействие на системы VEGF/рецептор VEGF и системы ангиопоэтин/рецептор Tie можно осуществлять одновременно или последовательно таким образом, чтобы биологическая реакция на воздействие на одну систему лиганд/рецептор и биологическая реакция на воздействие на вторую систему лиганд/рецептор перекрывались по времени. В альтернативном варианте комбинированное функциональное воздействие на системы VEGF/рецептор VEGF или системы ангиопоэтин/рецептор Tie и направленный перенос цитотоксических агентов с помощью систем VEGF/рецептор VEGF или систем ангиопоэтин/рецептор Tie можно осуществлять одновременно или последовательно таким образом, чтобы биологическая реакция на воздействие на систему лиганд/рецептор и направленный перенос цитотоксических агентов перекрывались по времени.

Изобретение относится также к субстанции, которая оказывает функциональное воздействие как на системы VEGF/рецептор VEGF, так и на системы ангиопоэтин/рецептор Tie, или которая направленно переносится с помощью как систем VEGF/рецептор VEGF, так и систем ангиопоэтин/рецептор Tie.

Системы VEGF/рецептор VEGF включают лиганды VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF и тирозинкиназные рецепторы VEGF-R1 (Flt1), VEGF-R2 (KDR/Flk1), VEGF-R3 (Flt4), а также их корецепторы (например, нейропилин-1). Системы ангиопоэтин/рецептор Tie включают Ang1, Ang2, Ang3/Ang4 и сходные с ангиопоэтином полипептиды, которые связываются с Tie1 или Tie2, и тирозинкиназные рецепторы Tie1 и Tie2.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно применять в медицинских целях для лечения заболеваний. К таким заболеваниям относятся, например, рак, метастазы рака, ангиогенез, включая ретинопатию и псориаз. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить перорально, парентерально или с использованием методов генотерапии.

Таким образом, настоящее изобретение относится также к применению фармацевтических композиций для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения опухолей, различных видов рака, псориаза, артрита, такого как ревматоидный артрит, гемангиомы, ангиофибромы, глазных болезней, таких как диабетическая ретинопатия, неоваскулярная глаукома, заболеваний почек, таких как гломерулонефрит, диабетической нефропатии, злокачественного нефросклероза, тромбического микроангиопатического синдрома, отторжении после трансплантации и гломерулопатии, фиброзных заболеваний, таких как цирроз печени, пролиферативных заболеваний мезангиальных клеток, атеросклероза, повреждений нервных тканей, для подавления образования асцитов у пациентов и подавления образования отеков, опосредуемых VEGF.

Приведенные ниже примеры служат для демонстрации осуществимости описанного изобретения, но не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Высокая эффективность в отношении ингибирования роста опухоли комбинации ингибирования системы VEGF А/рецептор VEGF и функционального воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Тiе2 по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности была продемонстрирована в опытах при использовании в качестве модели ксенотрансплантата человеческой меланомы линии A375v.

Клетки человеческой меланомы линии A375v стабильно трансфектировали для осуществления сверхэкспрессии внеклеточного нейтрализующего лиганд домена человеческого тирозинкиназного рецептора Tie2 (sTie2; соединение II) (Siemeister и др., Cancer Res. 59, 3185-3191, 1991). Для контроля клетки линии A375v стабильно трансфектировали “пустым” экспрессионным вектором (A375v/pCEP). Бестимусным (nu/nu) мышам линии Swiss вводили путем подкожной инъекции 1х10⁶ опухолевых клеток, трансфектированных A375v/sTie2 или A375v/pCEP соответственно. Животным, предназначенным для обработки соединением I, ежедневно в течение периода времени до 38 дней вводили перорально дозы (50 мг/кг) ингибитора тирозинкиназного рецептора VEGF, представляющего собой бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония (Wood и др., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000). Различные варианты обработок представлены в таблице 1. Рост опухоли оценивали путем измерения с помощью циркуля наибольшего диаметра и размера в перпендикулярном к нему направлении.

Таблица 1

Размер опухолей, полученных из контрольных клеток линии A375v/pCEP, без обработки (группа 1) достигал приблизительно 250 мм² (средняя площадь) через 24 дня (фиг.1). Обработка только ингибитором рецептора VEGF, бисукцинатом (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1 -ил]аммония (соединение I, группа обработки 2), или только воздействие на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 с помощью экспрессии sTie2 (соединение II, группа обработки 3), замедляли рост опухолей, в результате чего они достигали соответственно размера приблизительно 250 мм² за 31 день. Комбинация воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 с помощью экспрессии sTie2 и воздействия на систему VEGF/рецептор VEGF с помощью киназного ингибитора, бисукцината (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония (соединение I+соединение II, группа обработки 4) приводила к замедлению роста опухолей, в результате чего они достигали размера приблизительно 250 мм² за 38 дней.

Этот результат наглядно демонстрирует более высокую эффективность комбинации воздействия и на систему VEGF-A/рецептор VEGF и на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 по сравнению с воздействиями на каждую из систем по отдельности.

Пример 2

Комбинация функционального воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 и нейтрализации VEGF-A является более эффективной в отношении ингибирования роста опухоли, чем каждое из указанных воздействий по отдельности.

У бестимусных мышей индуцировали рост опухолей путем введения клеток линии A375v/sTie2 и линии A375v/pCEP согласно методу, описанному в примере 1. Животным, предназначенным для обработки соединением I, дважды в неделю в течение 4 недель вводили внутрибрюшинно по 200 мкг нейтрализующего VEGF-A моноклонального антитела (МАт) 4301-42-35 (Schlaeppi и др., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 125, 336-342, 1999). Различные варианты обработок представлены в таблице 2. Животных умерщвляли из этических соображений, когда объемы опухолей в группе 1 превышали приблизительно 1000 см³. Рост опухоли оценивали путем измерения с помощью циркуля наибольшего диаметра и размера в перпендикулярном к нему направлении.

Размер опухолей, полученных из контрольных клеток линии A375v/pCEP, без обработки (группа 1) достигал приблизительно 1000 мм³ (фиг.2) через 28 дней. Опухоли, которые обрабатывали нейтрализующим VEGF-A МАт 4301-42-35 (соединение I, группа обработки 2), через 28 дней достигали объема приблизительно 450 мм³. Воздействие на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 с помощью экспрессии sTie2 (соединение II, группа обработки 3), приводило к уменьшению роста опухолей, которые соответственно за 28 дней достигали объема приблизительно 600 мм³. Комбинация воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 с помощью экспрессии sTie2 и нейтрализации VEGF-А с помощью МАт 4301-42-35 (соединение I + соединение II, группа обработки 4), приводила к ингибированию роста опухолей, в результате чего за 28 дней они достигали объема приблизительно 250 мм³.

Эти данные наглядно демонстрируют более высокую эффективность комбинации нейтрализации VEGF-A и функционального воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности.

Пример 3

Комбинация функционального воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 и направленный перенос индуцирующего коагуляцию протеина с помощью системы VEGF/рецептор VEGF является более эффективной в отношении ингибирования роста опухоли по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности.

У бестимусных мышей индуцировали рост опухолей из клеток линии A375v/sTie2 и линии A375v/pCEP согласно методу, описанному в примере 1. Осуществляли экспрессию в Е. coli одноцепочечного антитела (scFv), специфически распознающего комплекс человеческий VEGF-A/рецептор I VEGF (WO 99/19361), и конъюгацию с индуцирующим коагуляцию рекомбинантным человеческим укороченным тканевым фактором (tTF) согласно методам, описанным у Ran и др. (Cancer Res. 58, 4646-4653, 1998). Когда опухоли достигали размера приблизительно 200 мм³, то животным, предназначенным для обработки соединением I, вводили внутривенно в день 0 и в день 4 дозы 20 мкг конъюгата scFv-tTF. Различные варианты обработок представлены в таблице 3. Животных умерщвляли из этических соображений, когда объемы опухолей в группе 1 превышали приблизительно 1000 см³. Рост опухоли оценивали путем измерения с помощью циркуля наибольшего диаметра и размера в перпендикулярном к нему направлении.

Размер опухолей, полученных из контрольных клеток линии A375v/pCEP, без обработки (группа 1) достигал приблизительно 1000 мм³ (фиг.3) через 28 дней. Опухоли, которые обрабатывали индуцирующим коагуляцию tTF, направленный перенос которого в комплекс VEGF-A/рецептор I VEGF осуществляли с помощью конъюгата scFv-tTF (соединение I, группа обработки 2), через 28 дней достигали объема приблизительно 500 мм³. Воздействие на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 с помощью экспрессии sTie2 (соединение II, группа обработки 3) приводило к уменьшению роста опухолей, которые соответственно за 28 дней достигали объема приблизительно 600 мм³. Комбинация воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2, осуществляемого с помощью экспрессии sTie2, и направленного переноса в комплекс VEGF-A/рецептор I VEGF (соединение I + соединение II, группа обработки 4) приводила к ингибированию роста опухолей, в результате чего за 28 дней они достигали объема приблизительно 300 мм³.

Эти данные наглядно демонстрируют более высокую эффективность комбинации направленного переноса в комплекс VEGF-A/рецептор I VEGF индуцирующего коагуляцию tTF и функционального воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности. Можно ожидать, что аналогичные результаты будут получены при осуществлении направленного переноса цитотоксических агентов в системы VEGF/рецептор VEGF.

Пример 4

Комбинация функционального воздействия на систему VEGF/рецептор VEGF и направленного переноса индуцирующего коагуляцию протеина в систему VEGF/рецептор VEGF является более эффективной в отношении ингибирования роста опухоли по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности.

У бестимусных мышей индуцировали рост опухолей из клеток линии A375v/pCEP согласно методу, описанному в примере 1. Животным, предназначенным для обработки соединением I, ежедневно в течение 28 дней вводили перорально дозы по 50 мг/кг ингибитора тирозинкиназного рецептора VEGF, представляющего собой бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1 -ил] аммония (Wood и др., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000). Соединение II представляло собой одноцепочечное антитело (scFv), специфически распознающее комплекс человеческий VEGF-A/рецептор I VEGF (WO 99/19361), которое экспрессировали в Е. coli и которое конъюгировали с индуцирующим коагуляцию рекомбинантным человеческим укороченным тканевым фактором (tTF) согласно методам, описанным у Ran и др. (Cancer Res. 58, 4646-4653, 1998). Когда опухоли достигали размера приблизительно 200 мм³, животным, предназначенным для обработки соединением II, вводили в день 0 и в день 4 внутривенно дозы по 20 мкг конъюгата scFv-tTF. Различные варианты обработок представлены в таблице 4. Животных умерщвляли из этических соображений, когда объемы опухолей в группе 1 превышали приблизительно 1000 см³. Рост опухоли оценивали путем измерения с помощью циркуля наибольшего диаметра и размера в перпендикулярном к нему направлении.

Размер опухолей, полученных из контрольных клеток линии A375v/pCEP, без обработки (группа 1) достигал приблизительно 1000 мм³ (фиг.4) через 28 дней. Обработка только ингибитором рецептора VEGF, представляющим собой бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил] аммония (соединение I, группа обработки 2), приводила к уменьшению объемов опухолей, в результате чего они достигали приблизительно 550 мм³. Объемы опухолей, которые обрабатывали индуцирующим коагуляцию tTF, направленный перенос которого в комплекс VEGF-A/рецептор I VEGF осуществляли с помощью конъюгата scFv-tTF (соединение II, группа обработки 3), через 28 дней достигали объема приблизительно 500 мм³. Комбинация ингибирования тирозинкиназного рецептора VEGF, осуществляемого с помощью бисукцината (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония, и направленного переноса в комплекс VEGF/рецептор VEGF (соединение I + соединение II, группа обработки 4), приводила к ингибированию роста опухолей, в результате чего за 28 дней они достигали объема приблизительно 400 мм³.

Эти данные наглядно демонстрируют более высокую эффективность комбинации направленного переноса индуцирующего коагуляцию tTF в комплекс VEGF-A/рецептор I VEGF и функционального воздействия на систему VEGF-A/рецептор I VEGF по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности. Можно ожидать, что аналогичные результаты будут получены при осуществлении направленного переноса цитотоксических агентов в системы ангиопоэтин/рецептор Tie.

Пример 5

Комбинация функционального воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 и специфического направленного переноса в эндотелий индуцирующего коагуляцию протеина является более эффективной в отношении ингибирования роста опухоли по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности.

У бестимусных мышей индуцировали рост опухолей из клеток линии A375v/sTie2 и A375v/pCEP согласно методу, описанному в примере 1. Слитый протеин (L19 scFv-tTF), содержащий одноцепочечное антитело L19, специфически распознающее онкогенный эмбриональный ED-B-домен фибронектина, и внеклеточный домен тканевого фактора, экспрессировали в Е. coli согласно методу, описанному у Nilsson и др., (Nat. Med., в печати). Кроме того, данные, касающиеся L19 scFv-tTF, представлены в докладе D. Neri и F. Nilsson (конференция “Advances in the application of monoclonal antibodies in clinical oncology”. Самос, Греция, 31 мая – 2 июня 2000 г.). Когда опухоли достигали размера приблизительно 200 мм³, то животным, предназначенным для обработки соединением I, вводили внутривенно однократную дозу 20 мкг L19 scFv-tTF в 200 мкл физиологического раствора. Различные варианты обработок представлены в таблице 5. Животных умерщвляли из этических соображений, когда объемы опухолей в группе 1 превышали приблизительно 1000 см³. Рост опухоли оценивали путем измерения с помощью циркуля наибольшего диаметра и размера в перпендикулярном к нему направлении.

Размер опухолей, полученных из контрольных клеток линии A375v/pCEP, без обработки (группа 1) достигал приблизительно 1000 мм³ (фиг.5) через 28 дней. Опухоли, обработанные индуцирующим коагуляцию L19 scFv-tTF (соединение I, группа обработки 2), через 28 дней достигали объема приблизительно 450 мм³. Воздействие на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 с помощью экспрессии sTie2 (соединение II, группа обработки 3) приводило к уменьшению роста опухолей, в результате чего они через 28 дней достигали соответственно объема приблизительно 600 мм³. Комбинация воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 с помощью экспрессии sTie2 и направленного переноса L19 scFv-tTF в эндотелий (соединение I+ соединение II, группа обработки 4) приводила к ингибированию роста опухолей, в результате чего через 28 дней их объем достигал приблизительно 250 мм³.

Эти данные наглядно демонстрируют более высокую эффективность комбинации направленного переноса L19 scFv-tTF в эндотелий и функционального воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности.

Пример 6

Комбинация функционального воздействия на систему VEGF/рецептор VEGF и направленного переноса в эндотелий специфического индуцирующего коагуляцию протеина является более эффективной в отношении ингибирования роста опухоли по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности.

У бестимусных мышей индуцировали рост опухолей из клеток линии A375v/pCEP согласно методу, описанному в примере 1. Животным, предназначенным для обработки соединением I, ежедневно в течение 28 дней вводили перорально дозы по 50 мг/кг ингибитора тирозинкиназного рецептора VEGF, представляющего собой бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония (Wood и др., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000). Соединение II представляло собой слитый протеин L19 scFv-tTF, описанный в примере 5. Когда размер опухолей достигал приблизительно 200 мм³, животным, предназначенным для обработки соединением II, вводили внутривенно однократную дозу 20 мкг L19 scFv-tTF в 200 мкл физиологического раствора. Различные варианты обработок представлены в таблице 6. Животных умерщвляли из этических соображений, когда объемы опухолей в группе 1 превышали приблизительно 1000 см³. Рост опухоли оценивали путем измерения с помощью циркуля наибольшего диаметра и размера в перпендикулярном к нему направлении.

Размер опухолей, полученных из контрольных клеток линии A375v/pCEP, без обработки (группа 1) достигал приблизительно 1000 мм³ (фиг.6) через 28 дней. Обработка только ингибитором тирозинкиназного рецептора VEGF, представляющим собой бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония (соединение I, группа обработки 2), приводила к ингибированию роста опухолей, в результате чего они достигали размера приблизительно 550 мм³. Опухоли, обработанные путем направленного переноса в эндотелий индуцирующим коагуляцию L19 scFv-tTF (соединение II, группа обработки 3), через 28 дней достигали объема приблизительно 450 мм³. Комбинация ингибирования тирозинкиназного рецептора VEGF бисукцинатом (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония и направленного переноса в комплекс VEGF/рецептор VEGF (соединение I + соединение II, группа обработки 4) приводила к ингибированию роста опухолей, в результате чего через 28 дней их объем достигал приблизительно 200 мм³.

Эти данные наглядно демонстрируют более высокую эффективность комбинации направленного переноса L19 scFv-tTF в эндотелий и функционального воздействия на систему VEGF/рецептор VEGF по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности.

Описание чертежей

На фиг.1 представлены данные, иллюстрирующие более высокую эффективность в отношении ингибирования роста опухоли, которая достигается при использовании комбинации воздействия на систему VEGF-A/рецептор VEGF, осуществляемого с помощью специфического тирозинкиназного ингибитора, и на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2, осуществляемого с помощью домена растворимого рецептора (виды обработок групп 1-4 представлены в таблице 1). Сокращения имеют следующие значения:

На фиг.2 представлены данные, иллюстрирующие более высокую эффективность в отношении ингибирования роста опухоли, достигаемую при использовании комбинации нейтрализации VEGF-A и функционального воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2, по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности (виды обработок групп 1-4 представлены в таблице 2).

На фиг.3 представлены данные, иллюстрирующие более высокую эффективность в отношении ингибирования роста опухоли, достигаемую при использовании комбинации направленного переноса индуцирующего коагуляцию tTF в комплекс VEGF/рецептор I VEGF, осуществляемого с помощью конъюгата scFv-tTF, и функционального воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2, по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности (виды обработок групп 1-4 представлены в таблице 3).

На фиг.4 представлены данные, иллюстрирующие более высокую эффективность в отношении ингибирования роста опухоли, достигаемую при использовании комбинации направленного переноса индуцирующего коагуляцию tTF в комплекс VEGF/рецептор I VEGF, осуществляемого с помощью конъюгата scFv-tTF, и функционального воздействия на систему VEGF/рецептор I VEGF, осуществляемого с помощью ингибитора тирозинкиназного рецептора VEGF, представляющего собой бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония, по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности (виды обработок групп 1-4 представлены в таблице 4).

На фиг.5 представлены данные, иллюстрирующие более высокую эффективность в отношении ингибирования роста опухоли, достигаемую при использовании комбинации направленного переноса индуцирующего коагуляцию слитого протеина L19 scFv-tTF в эндотелий и функционального воздействия на систему ангиопоэтин/рецептор Tie2 по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности (виды обработок групп 1-4 представлены в таблице 5).

На фиг.6 представлены данные, иллюстрирующие более высокую эффективность в отношении ингибирования роста опухоли, достигаемую при использовании комбинации направленного переноса индуцирующего коагуляцию слитого протеина L19 scFv-tTF в эндотелий и функционального воздействия на систему VEGF/рецептор VEGF, осуществляемого с помощью ингибитора тирозинкиназного рецептора VEGF, представляющего собой бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония, по сравнению с каждым из указанных воздействий по отдельности (виды обработок групп 1-4 представлены в таблице 6).

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве соединения I один или несколько агентов, которые ингибируют биологическую функцию одной или нескольких систем сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF)/рецептор VEGF, и содержащая в качестве соединения II один или несколько агентов, которые ингибируют биологическую функцию одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie, где один или несколько агентов, используемых в качестве соединения I, отличаются от одного или нескольких агентов, используемых в качестве соединения II.

2. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве соединения I один или несколько цитотоксических агентов, которые направленно переносятся в эндотелий с помощью одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF, и содержащая в качестве соединения II один или несколько агентов, которые ингибируют биологическую функцию одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie.

3. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве соединения I один или несколько агентов, которые ингибируют биологическую функцию одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF или одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie, и содержащая в качестве соединения II один или несколько цитотоксических агентов, которые направленно переносятся в эндотелий с помощью одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF или одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie, где один или несколько агентов, где соединение I и соединение II не ингибируют одну и ту же систему рецепторов.

4. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве соединения I один или несколько агентов, которые ингибируют биологическую функцию одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF, и содержащая в качестве соединения II один или несколько цитотоксических агентов, которые направленно переносятся в эндотелий с помощью одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie.

5. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве соединения I один или несколько цитотоксических агентов, которые направленно переносятся в эндотелий с помощью одной или нескольких систем VEGF/рецептор VEGF, и содержащая в качестве соединения II один или несколько агентов, которые направленно переносятся в эндотелий с помощью одной или нескольких систем ангиопоэтин/рецептор Tie.

6. Фармацевтическая композиция по пп.1-5, которая предназначена для одновременного или последовательного терапевтического введения при ингибировании ангиогенезиса у пациентов.

7. Фармацевтическая композиция по пп.1-5, которая содержит в качестве соединения I по меньшей мере одно(у) из

а) соединений, которые ингибируют активность тирозинкиназного рецептора,

б) соединений, которые ингибируют связывание лиганда с рецепторами,

в) соединений, которые ингибируют активацию внутриклеточных путей передачи сигнала рецепторов,

г) соединений, которые ингибируют или активируют экспрессию лиганда или рецептора VEGF- или Tie-рецепторной системы,

д) систем введения, таких как антитела, лиганды, обладающие высокой афинностью к связыванию олигонуклеотиды или олигопептиды, или липосомы, обеспечивающие направленный перенос цитотоксических агентов или индуцирующих коагуляцию агентов в эндотелий с помощью распознавания систем VEGF/рецептор VEGF или ангиопоэтин/рецептор Tie,

е) систем введения, таких как антитела, лиганды, обладающие высокой афинностью к связыванию олигонуклеотиды или олигопептиды, или липосомы, которые направленно переносятся в эндотелий и индуцируют некроз или апоптоз.

8. Фармацевтическая композиция по пп.1-5, которая содержит в качестве соединения II по меньшей мере одно(у) из

а) соединений, которые ингибируют активность тирозинкиназного рецептора,

б) соединений, которые ингибируют связывание лиганда с рецепторами,

в) соединений, которые ингибируют активацию внутриклеточных путей передачи сигнала рецепторов,

г) соединений, которые ингибируют или активируют экспрессию лиганда или рецептора VEGF- или Tie-рецепторной системы,

д) систем введения, таких как антитела, лиганды, обладающие высокой афинностью к связыванию олигонуклеотиды или олигопептиды, или липосомы, обеспечивающие направленный перенос цитотоксических агентов или индуцирующих коагуляцию агентов в эндотелий с помощью распознавания систем VEGF/рецептор VEGF или ангиопоэтин/рецептор Tie,

е) систем введения, таких как антитела, лиганды, обладающие высокой афинностью к связыванию олигонуклеотиды или олигопептиды, или липосомы, которые направленно переносятся в эндотелий и индуцируют некроз или апоптоз.

9. Фармацевтическая композиция по пп.1-8, которая содержит в качестве соединения I и/или II по меньшей мере одну субстанцию, имеющую последовательность из числа последовательностей, представленных в SEQ ID No 1-59.

10. Фармацевтическая композиция по пп.1-8, которая содержит в качестве соединения I и/или II субстанции, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID No 34a.

11. Фармацевтическая композиция по пп.1-8, которая содержит в качестве соединения I и/или II по меньшей мере одну из субстанций, выбранную из соединения sTie2, моноклонального антитела МАт 4301-42-35, конъюгата scFv-tTF и/или конъюгата L19 scFv-tTF.

12. Фармацевтическая композиция по пп.1-8, которая содержит в качестве соединения I и/или II по меньшей мере одну низкомолекулярную субстанцию общей формулы I

где r обозначает число от 0 до 2,

n обозначает число от 0 до 2;

R₃ и R₄ а) каждый независимо друг от друга обозначает (низш.)алкил,

б) вместе образуют мостик общей частичной формулы II

где связь осуществляется через два концевых атома углерода и m обозначает число от 0 до 4; или

в) вместе образуют мостик частичной формулы III

где один или два из кольцевых членов T₁, Т₂, Т₃, Т₄ обозначают азот, а каждый из остальных обозначает СН, и связь осуществляется через атомы T₁ и Т₄;

G обозначает C₁-С₆алкил, С₂-С₆алкилен или С₂-С₆алкенилен; или С₂-С₆алкилен или С₃-С₆алкенилен, замещенные ацилокси- или гидроксигруппой; -СН₂-O-, -СН₂-S-, -CH₂-NH-, -СН₂-О-СН₂-, -CH₂-S-CH₂-, -CH₂-NH-CH₂-, окса- (-O-), тиа- (-S) или иминогруппу (-NH-),

А, В, D, Е и Т каждый независимо друг от друга обозначает N или СН, при условии, что не более трех из указанных заместителей обозначают N,

Q обозначает (низш.)алкил, (низш.)алкокси или галоген,

R₁ и R₂ каждый независимо друг от друга обозначает Н или (низш.)алкил,

Х обозначает имино-, окса- или тиагруппу;

Y обозначает водород, незамещенный или замещенный арил, гетероарил или незамещенный или замещенный циклоалкил; и

Z обозначает аминогруппу, моно- или дизамещенную аминогруппу, галоген, алкил, замещенный алкил, гидроксигруппу, этерифицированную с образованием простого или сложного эфира гидроксигруппу, нитро-, циано-, карбоксигруппу, этерифицированную с образованием сложного эфира карбоксигруппу, алканоил, карбамоил, N-моно- или N,N-дизамещенный карбамоил, амидино-, гуанидино-, меркапто-, сульфо-, фенилтио-, фенил(низш.)алкилтио-, алкилфенилтиогруппу, фенилсульфинил, фенил(низш.)алкилсульфинил, алкилфенилсульфинил, фенилсульфонил, фенил(низш.)алкансульфонил или алкилфенилсульфонил, причем, если присутствуют более одного радикала Z (m2), то заместители Z могут быть одинаковыми или различными, и где связи, указанные стрелкой, представляют собой простые или двойные связи; или N-оксид указанного соединения, где один или несколько атомов азота несут атом кислорода,

или его соль,

и/или соединение общей формулы IV

где А обозначает группу =NR²,

W обозначает атом кислорода, атом серы, два атома водорода или группу =NR⁸,

Z обозначает группу =NR¹⁰ или

=N-, -N(R¹⁰)-(CH₂)_q-, C₁-С₆алкил с прямой или разветвленной цепью или группу

или А, Z и R¹ вместе образуют группу

m, n и о обозначают числа от 0 до 3,

q обозначает число от 1 до 6,

R_a, R_b, R_c, R_d, R_e, R_f каждый независимо друг от друга обозначает водород, C₁-С₄алкил или группу =NR¹⁰ и/или R_a и/или R_b вместе с R_c и/или R_d или R_c вместе с R_e и/или R_f образуют связь, или до двух групп из числа R_a-R_f образуют мостик с R¹ или R², содержащий до 3 атомов углерода,

Х обозначает группу =NR⁹ или =N-,

Y обозначает группу -(СН₂)_р,

р обозначает целое число от 1 до 4,

R¹ обозначает незамещенный или необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена C₁-С₆алкил или C₁-С₆алкил или C₁-С₆алкокси, который необязательно замещен одним или несколькими атомами галогена, или обозначает незамещенный или замещенный арил или гетероарил,

R² обозначает водород или C₁-С₆алкил или вместе с Z или R¹ образует с R_a-R_f мостик, содержащий до 3 кольцевых атомов,

R³ обозначает моноциклический или бициклический арил или гетероарил, который является незамещенным или необязательно замещен одним или несколькими атомами галогена, C₁-С₆алкилом, C₁-С₆алкокси- или гидроксигруппой,

R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ каждый независимо друг от друга обозначает водород, галоген или C₁-С₆алкокси, C₁-С₆алкил или C₁-С₆карбоксиалкил, которые являются незамещенными или необязательно замещены одним или несколькими атомами галогена, или R⁵ и R⁶ вместе образуют группу

R⁸, R⁹ и R¹⁰ каждый независимо друг от друга обозначает водород или C₁-С₆алкил,

а также его изомеры и соли, и/или соединение общей формулы V

где R¹ обозначает группу

где R⁵ обозначает хлор, бром или группу -ОСН₃,

где R⁷ обозначает -СН₃ или хлор,

где R⁸ обозначает -СН₃, фтор, хлор или -CF₃,

где R⁴ обозначает фтор, хлор, бром, -CF₃, -N=C, -СН₃-OCF₃ или -СН₂ОН

где R⁶ обозначает -СН₃ или хлор

R² обозначает пиридил или группу

и

R³ обозначает водород или фтор,

а также его изомеры и соли.

13. Фармацевтическая композиция по п.12, которая содержит в качестве соединения I и/или II бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония.

14. Фармацевтическая композиция по пп.1-13, которая содержит в качестве соединения I бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония, соединение sTie2, моноклональное антитело МАт 4301-42-35, конъюгат scFv-tTF и/или конъюгат L19 scFv-tTF, а в качестве соединения II содержит бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония, соединение sTie2, моноклональное антитело МАт 4301-42-35, конъюгат scFv-tTF и/или конъюгат L19 scFv-tTF при условии, что соединение I не является идентичным соединению II.

15. Фармацевтическая композиция по пп.1-14, которая содержит в качестве соединения I бисукцинат (4-хлорфенил)[4-(4-пиридилметил)фталазин-1-ил]аммония, а в качестве соединения II содержит соединение sTie2, моноклональное антитело МАт 4301-42-35, конъюгат scFv-tTF и/или конъюгат L19 scFv-tTF.

16. Фармацевтическая композиция по пп.1-15, которая содержит в качестве соединения I моноклональное антитело МАт 4301-42-35, а в качестве соединения II содержит соединение sTie2 и/или конъюгат scFv-tTF.

17. Фармацевтическая композиция по пп.1-15, которая содержит в качестве соединения I конъюгат scFv-tTF, а в качестве соединения II содержит соединение sTie2 и/или моноклональное антитело МАт 4301-42-35.

18. Фармацевтическая композиция по пп.1-15, которая содержит в качестве соединения I конъюгат L19 scFv-tTF, а в качестве соединения II содержит соединение sTie2.

19. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-18, предназначенная для приготовления лекарственного средства для лечения опухолей, различных видов рака, псориаза, артрита, гемангиомы, ангиофибромы, глазных болезней, заболеваний почек, тромбического микроангиопатического синдрома, отторжений после трансплантации и гломерулопатии, фиброзных заболеваний, пролиферативных заболеваний мезангиальных клеток, атеросклероза и повреждений нервных тканей, подавления образования асцитов и подавления образования отеков у пациентов.

20. Фармацевтическая композиция по п.19, где артрит представляет собой ревматоидный артрит.

21. Фармацевтическая композиция по п.19, где глазные болезни представляют собой диабетическую ретинопатию, неоваскулярную глаукому.

22. Фармацевтическая композиция по п.19, где заболевания почек представляют собой гломерулонефрит, диабетическую нефропатию, злокачественный нефросклероз.

23. Фармацевтическая композиция по п.19, где фиброзное заболевание представляет собой цирроз печени.

Приоритет по пунктам и признакам:

23.06.2000 по пп.1-10, 12, 13, 16 и 17;

28.06.2000 по пп.11, 14, 15, 18 и 19-23 в части альтернативы, представляющей собой конъюгат L19scFv-tTF.

РИСУНКИ

PD4A – Изменение наименования обладателя патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:

БАЙЕР ШЕРИНГ ФАРМА АКЦИЕНГЕЗЕЛЛЬШАФТ (DE)

Адрес для переписки:

129090, Москва, ул.Б.Спасская, 25, стр.3, ООО “Юридическая фирма Городисский и Партнеры”

Извещение опубликовано: 20.03.2010 БИ: 08/2010