Патент на изобретение №2292045

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ И ЛИМФОЦИТОВ К ИНСУЛИНУ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биофизическим методам исследования крови. Сущность способа: степень чувствительности мембран клеток крови к инсулину определяют путем приготовления, по крайней мере, трех проб суспензии клеток по 50 мкл с равномерно возрастающей дозой инсулина, имеющего концентрацию 1×10^-5 М, при этом суспензия лимфоцитов должна содержать 1×10⁶ кл/мл, а суспензия эритроцитов – иметь оптическую плотность 0,7 ед. в 0,5 см кювете при длине волны поглощения 650 нм. В 1-ую пробу добавляют 1 мкл свежеприготовленного раствора инсулина, во 2-ую – 5 мкл, в 3-ю – 10 мкл, и после определения величины флуоресценции каждой пробы рассчитывают среднюю арифметическую величину флуоресценции F_cp. Чувствительность мембран оценивают по флуориметрической шкале, при этом F_cp менее 30 ед. фл. свидетельствует о пониженной степени чувствительности, F_cp от 30 до 60 ед. фл. свидетельствует о средней степени чувствительности, F_cp более 60 ед. фл. – о повышенной степени чувствительности. Использование способа позволяет повысить точность и информативность оценки степени чувствительности мембран эритроцитов и лимфоцитов к инсулину. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к биофизическим методам исследования крови. Может быть использовано для характеристики инсулинзависимой реакции биомембран при гормональных нарушениях.

Известен способ количественной оценки чувствительности эритроцитарных мембран к инсулину [1]. Способ представляет собой оценку чувствительности эритроцитарных мембран к инсулину по разности констант связывания флуоресцирующего индикатора с эритроцитарными мембранами при спектрофлуориметрическом исследовании опытной и контрольной проб эритроцитов в присутствии инсулина.

Известный способ является недостаточно точным, т.к. позволяет оценить чувствительность эритроцитарных мембран на одну дозу инсулина, которая может оказаться недостаточной для проявления реакции. Кроме того, оценивается чувствительность одного типа мембран – эритроцитарных. Между тем, при ряде состояний, например при патологии иммунной системы, страдают иммунокомпетентные клетки – лимфоциты. Возможность оценки чувствительности только мембран эритроцитов способствует снижению возможностей известного способа.

Задача изобретения – создание информативного способа оценки степени чувствительности мембран эритроцитов и лимфоцитов к инсулину.

Задача решается тем, что проводят спектрофлуориметрическое исследование инкубированных мембран эритроцитов и лимфоцитов в присутствии инсулина и флуоресцирующего зонда. Для этого готовят, по крайней мере, три пробы суспензии клеток по 50 мкл с равномерно возрастающей дозой инсулина, имеющего концентрацию 1×10^-5 М. При этом суспензия лимфоцитов должна содержать 1×10⁶ кл/мл, а суспензия эритроцитов – иметь оптическую плотность 0,7 ед. в 0,5 см кювете при длине волны поглощения 650 нм, причем в 1-ую пробу добавляют 1 мкл свежеприготовленного раствора инсулина, во 2-ую – 5 мкл, в 3-ю – 10 мкл. После определения величины флуоресценции каждой пробы рассчитывают среднюю арифметическую величину флуоресценции F_cp. Результаты выражают в единицах флуоресценции (ед. фл.). Степень чувствительности мембран оценивают по флуориметрической шкале: F_cp менее 30 ед. фл. свидетельствует о пониженной степени чувствительности; F_cp от 30 до 60 ед. фл. – о средней степени чувствительности; F_cp более 60 ед. фл. – о повышенной степени чувствительности.

Изменение флуоресценции в мембранах эритроцитов или лимфоцитов крови в результате реакции связывания различных доз инсулина свидетельствует о нарушении действия периферического эффекторного звена инсулина на уровне биомембран клеток крови и является количественным выражением степени чувствительности мембран этих клеток к инсулину.

Способ осуществляют следующим образом. Лимфоциты или эритроцигы выделяют из цельной гепаринизированной венозной крови на градиенте фиколл-верографин. Суспензию лимфоцитов разводят до концентрации 1×10⁶ кл/мл, а суспензию эритроцитов – до оптической плотности 0,7 ед. в 0,5 см кювете при длине волны поглощения 650 нм. Готовят раствор инсулина с концентрацией 1×10^-5 М. Готовят, например, 3 пробы суспензии эритроцитов или лимфоцитов, помещая по 50 мкл в каждую пробирку. Добавляют 1 мкл свежеприготовленного раствора инсулина в первую пробу, 5 мкл – во 2-ую, 10 мкл – в 3-ю. Инкубируют все 3 пробы при комнатной температуре в течение достаточного для взаимодействия инсулина и клеток времени, например в течение часа. К каждой пробе добавляют флуоресцентный краситель, например 5 мкл анилино-нафталин-8-сульфоната натрия (АНС) при концентрации раствора 40 мкМ в этаноле. Через одну минуту, т.е. время, достаточное для связывания АНС с биомембраной, в каждой пробе регистрируют флуоресценцию на спектрофлуориметре при длине волны 480 нм. Определяют среднюю арифметическую величину флуоресценции F_cp.. Степень чувствительности мембран оценивают по флуориметрической шкале.

По результатам выявленной степени чувствительности мембран можно планировать дальнейшие диагностические и лечебные мероприятия.

Способ можно продемонстрировать на следующих примерах.

Пример 1. Больной А.

Проведена оценка степени чувствительности мембран эритроцитов к инсулину.

Результаты измерения флуоресценции: 1 проба – 43,3 ед. фл., 2 проба – 56,4 ед. фл., 3 проба – 60,6 ед. фл.

F_cp равна 53,43 ед. фл. Это соответствует средней степени чувствительности мембран к воздействию инсулина.

Пример 2. Больной Б.

Проведена оценка степени чувствительности мембран эритроцитов к инсулину. Результаты измерения флуоресценции: 1 проба – 13,3 ед. фл., 2 проба – 24,6 ед. фл., 3 проба – 48,6 ед. фл.

F_cp равна 28,83 ед. Это соответствует пониженной степени чувствительности мембран к воздействию инсулина.

Пример 3. Больной В.

Проведена оценка степени чувствительности мембран лимфоцитов к инсулину.

Результаты измерения флуоресценции: 1 проба – 13,2 ед. фл.; 2 проба – 16,2 ед. фл.; 3 проба – 19,0 ед. фл.

F_cp равна 16,1 ед. Это соответствует низкому уровню чувствительности клеточных мембран к воздействию инсулина.

Пример 4. Больной Г.

Проведена оценка степени чувствительности мембран лимфоцитов к инсулину.

Результаты измерения флуоресценции: 1 проба – 10,8 ед. фл., 2 проба – 25,6 ед. фл., 3 проба – 53,7 ед. фл.

F_cp равна 30,03 ед. фл. Это соответствует среднему уровню чувствительности клеточных мембран к воздействию инсулина.

Пример 5. Больной Д.

Проведена оценка степени чувствительности мембран лимфоцитов к инсулину.

Результаты измерения флуоресценции: 1 проба – 50,2 ед. фл., 2 проба – 65,1 ед. фл., 3 проба – 76,0 ед. фл.

F_cp равна 63,7 ед. фл. Это соответствует повышенному уровню чувствительности клеточных мембран к воздействию инсулина.

Применение способа способствует повышению информативности и точности оценки чувствительности клеточных мембран к инсулину.

Источники информации

1. Терещенко В.П., Манчук В.Т. Способ количественной оценки чувствительности эритроцитарных мембран к инсулину. RU 94024809 А1, заявлено 29.06.1994; опубл. 27.09.1996.

Формула изобретения

Способ оценки степени чувствительности мембран клеток крови к инсулину, включающий спектрофлуориметрическое исследование инкубированных мембран клеток в присутствии инсулина и флуоресцирующего зонда, отличающийся тем, что готовят, по крайней мере, три пробы суспензии клеток по 50 мкл с равномерно возрастающей дозой инсулина, имеющего концентрацию 1·10^-5 М, при этом суспензия лимфоцитов должна содержать 1·10⁶ кл/мл, а суспензия эритроцитов иметь оптическую плотность 0,7 ед. в 0,5 см кювете при длине волны поглощения 650 нм, причем в 1-ю пробу добавляют 1 мкл свежеприготовленного раствора инсулина, во 2-ю – 5 мкл, в 3-ю – 10 мкл, и после определения величины флуоресценции каждой пробы рассчитывают среднюю арифметическую величину флуоресценции F_cp, и чувствительность мембран оценивают по флуориметрической шкале, при этом F_cp менее 30 ед. фл. свидетельствует о пониженной степени чувствительности, F_cp от 30 до 60 ед. фл. свидетельствует о средней степени чувствительности, F_cp более 60 ед. фл. – о повышенной степени чувствительности.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 12.03.2007

Извещение опубликовано: 10.07.2008 БИ: 19/2008