Патент на изобретение №2291437

Published by on

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(19)

(11)

2291437

(13)

(51) МПК

G01N33/563 (2006.01)
G01N33/68 (2006.01)
G01N33/74 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Статус: по данным на 17.12.2010 – прекратил действие

(21), (22) Заявка: 2004131135/15, 26.10.2004

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

26.10.2004

(43) Дата публикации заявки: 10.04.2006

(46) Опубликовано: 10.01.2007

(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске:
KULSENG В, Soluble tumor necrosis factor receptors in sera from patients with insulin-dependent diabetes mellitus: relations to duration and complications of disease Acta Diabetol. 1999 Jun; 36(1-2):99-105. WU JT. et al Review of diabetes: identification of markers for early detection, glycemic control, and monitoring clinical complications J Clin

Адрес для переписки:

129224, Москва, ул. Северодвинская, 13, кв.159, А.Б. Полетаеву

(72) Автор(ы):

Полетаев Александр Борисович (RU),
Абросимова Алина Анатольевна (RU),
Соколов Михаил Анатольевич (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Медицинский исследовательский центр “Иммункулус” (RU)

(54) СПОСОБ МОНИТОРИНГА ЗА СОСТОЯНИЕМ БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ И РАЗВИТИЕМ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ И СОСУДИСТЫХ ЕГО ОСЛОЖНЕНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для оценки состояния больных сахарным диабетом и развитием у них неврологических и сосудистых осложнений. Сущность изобретения состоит в том, что определяют иммунореактивность сыворотки крови по отношению к инсулину, к антиинсулиновым антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, к антиантиинсулиновым антителам, связывающим антитела к инсулину и антитела к фактору роста или их антигенсвязывающим фрагментам и антигену ANCA и по увеличению иммунореактивности сыворотки по отношению к определяемым параметрам относительно нормы определяют степень прогрессии сахарного диабета и неворологических и сосудистых осложнений. Техническим результатом является повышение точности мониторинга за состоянием больных сахарным диабетом.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”Lab Anal. 1993; 7(5):293-300. WINOCOUR PH et al. The relevance of persistent C-peptide secretion in type 1 (insulin-dependent) diabetes mellitus to glycaemic control and diabetic complications Diabetes Res Clin Pract. 1990 Apr; 9(1):23-35. EP 0569800, 18.11.1993.

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии и эндокринологии, и может найти применение в оценке эффективности терапии сахарного диабета 1 и 2 типа.

Известно, что иммунная система здорового человека постоянно продуцирует естественные регуляторные аутоантитела (ауто-АТ) к любым антигенным компонентам собственного организма, в том числе ауто-АТ к компонентам клеток поджелудочной железы и инсулиновым рецепторам (Полетаев А.Б. и др. Регуляторная метасистема, М.: Медицина, 2002). Синтез ауто-АТ в здоровом организме поддерживается в определенных границах, необходимых для выполнения последними определенных регуляторных функций, а их избыточная, равно как и недостаточная продукция могут вести к развитию патологических состояний, в том числе инсулинзависимого сахарного диабета (СД типа 1) и инсулиннезависимого сахарного диабета (СД типа 2), а также сосудистых и неврологических осложнений основного заболевания, нередко ведущих к стойкой инвалидности.

Вышесказанное явилось основанием для разработки предлагаемого способа, пригодного для диагностической и прогностической оценки уровней ряда ауто-АТ, содержание которых отражает уровень аутоиммуноагрессии к инсулинсекретирующим клеткам поджелудочной железы при СД-1, к периферическим инсулиновым рецепторам при СД-2, а также осуществлять контроль за развитием основных осложнений сахарного диабета (сосудистых и неврологических).

Общепринятым способом диагностики сахарного диабета и мониторинга за их состоянием является определение уровня сахара в крови (В.В.Медведев, Ю.З.Волчек. “Клиническая лабораторная диагностика” “Гиппократ” СПб, 1997, стр.154).

Недостатком этого известного способа является его сравнительно невысокая надежность и невозможность мониторинга за развитием основных сосудистых и неврологических осложнений, сопровождающих сахарный диабет.

Задача изобретения – способ мониторинга за состоянием больных сахарным диабетом и развитием неврологических и сосудистых его осложнений, позволяющий более объективно судить о прогрессии сахарного диабета и о развитии неврологических и сосудистых осложнений.

Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что определяют иммунореактивность сыворотки крови по отношению к инсулину, к антиинсулиновым антителам (связывающим антитела к рецепторам инсулина) или их антигенсвязывающим фрагментам, антиантиинсулиновым антителам, связывающим антитела к инсулину и антитела к фактору роста нервов (антиидиотипам антиинсулиновых антител) или их антигенсвязывающим фрагментам и антигену ANCA и при увеличении иммунореактивности на 6-15% по отношению к инсулину и/или к антиинсулиновым антителам или их антигенсвязывающим фрагментам делают вывод об умеренной прогрессии сахарного диабета, а при одновременном в такой же степени повышении иммунореактивности по отношению к антиантиинсулиновым антителам, связывающим антитела к инсулину и антитела к фактору роста нервов или антигенсвязывающим фрагментам делают вывод об умеренной прогрессии диабетической нейропатии, а при одновременном повышении в такой же степени иммунореактивности по отношению к ANCA делают вывод о диабетической ангиопатии, а при более высокой иммунореактивности по отношению к перечисленным реагентам делают вывод о высокой степени прогрессии сахарного диабета и его неврологических и сосудистых осложнений.

Практическое осуществление способа включает следующие стадии:

I. Сорбцию на стандартные 96-луночные полистироловые планшеты для ИФА а) инсулина, б) молекул идиотипических антиинсулиновых антител (или их фрагментов) – иммунохимических аналогов инсулиновых рецепторов; б) антиидиотипических антител (антиантител), специфически взаимодействующих с антителами к инсулину; в) анионных белков цитоплазмы нейтрофилов (ANCA);

II. Нанесение на них тестируемых проб сывороток пациентов и эталонной референс-сыворотки, полученной от здоровых лиц;

III. Выявление образующихся антигенантительных комплексов с помощью конъюгатов вторичных (антивидовых) иммуноглобулинов, меченных пероксидазой хрена или иным ферментом;

IV. Проявление реакции в лунках планшета с помощью субстрата-хромогена;

V. Сравнение интенсивности реакции в лунках, содержащих тестируемые сыворотки с лунками, содержащими референс-сыворотку.

Для проведения анализа ЭЛИ-ДИА-Тест требуется около 0,03 мл сыворотки крови обследуемого (например, полученной из подушечки пальца).

ПОЛУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ПО ПРЕДЛАГАЕМОМУ СПОСОБУ (ТЕСТ-СИСТЕМЕ ЭЛИ-ДИА-ТЕСТ).

1. В работе используется коммерческий препарат инсулина.

2. Получение антиинсулиновых антител или их антигенсвязывающих фрагментов проводили с помощью стандартных процедур иммуноаффинной хроматографии, как описано ранее (Полетаев А.Б. и др. Ж. Нейроиммунология, 2003, 1, 1, 11-17).

3. Получение антиантиинсулиновых антител или их антигенсвязывающих фрагментов проводили с помощью стандартных процедур иммуноаффинной хроматографии, как описано ранее (Полетаев А.Б. и др. Ж. Нейроиммунология, 2003, 1, 1, 11-17).

4. Получение антигена ANCA проводили следующим образом: из цельной крови человека выделяли фракцию нейтрофилов, экстрагировали ее с помощью нейтрального буферного раствора (например, трис-хлоридного), экстракт пропускали через анионообменную колонку (например, ДЕАЕ-целлюлоза), связавшийся материал элюировали солевым раствором (например, 1 М хлоридом натрия) и использовали в работе.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ НЕПРЯМОГО ИФА.

1. Для сорбции на стандартные 96-луночные плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа готовили растворы каждого из компонентов тест-системы на карбонатном буфере рН 9-10. Приготовленные растворы вносили в отдельные лунки планшета и инкубировали в течение 1-24 ч.

2. После инкубации отмывали планшеты отмывочным буфером (например, 0.15 М NaCl с 0.05% твин-20) и проводили тестирование сывороток; для этого:

а) в отдельных флаконах или ванночках для ИФА готовили разведения сывороток (например, 1:200) на отмывочном буфере,

б) вносили разведенные сыворотки в лунки планшета,

в) планшеты инкубировали ночь при +4°С или 1-3 ч при +37…+39°С,

г) отмывали планшеты и проявляли реакцию с помощью стандартных приемов, используя конъюгат пероксидазы хрена (или иного фермента) с антителами к иммуноглобулинам IgG человека и раствор субстрата-хромогена (например, 0.01-0.05% о-фенилендиамин с 0.001-0.01% перекиси водорода на 0.01-0.05 М цитрат-фосфатном буфере в случае применения пероксидазных конъюгатов).

3. Инкубировали планшеты в темноте 10-30 мин при комнатной температуре.

4. По достижении оптимального уровня окрашивания (обычно через 10-20 мин инкубации в темноте) реакцию останавливают добавлением 0.2-0.4 М кислоты.

5. Регистрация результатов реакции: интенсивность окрашивания оценивают с помощью иммуноферментного анализатора (ИФА-ридера) любой модели.

6. Обработка полученных данных:

по полученным значениям оптической плотности лунок рассчитывают относительную интенсивность реакции тестировавшихся сывороток с каждым из компонентов тест-системы ЭЛИ-ДИА-Тест по отношению к реакции контрольной сыворотки с тем же антигеном за минусом 100 единиц и выражают в условных единицах. Для расчета используют формулу:

где

R(aг1) – величина оптической плотности анализируемой сыворотки крови в лунках с антигеном-1;

R(агn) – величина оптической плотности анализируемой сыворотки крови в лунках с антигеном-n;

R(к1…кn) – величина оптической плотности контрольной сыворотки крови в лунках с антигенами 1…n.

7. Интерпретация полученных данных:

а) в случае если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов тест-системы не выходила за пределы +5% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят к 1-й классификационной группе (лица без прогрессии основного заболевания и без признаков развития осложнений),

б) в случае если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов выходит за пределы группы-1, но не превышает +15% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят ко 2-й классификационной группе или группе умеренных отклонений (лица с прогрессией СД и/или его осложнениями умеренной выраженности),

в) в случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов выходит за пределы 1-й и 2-й групп, данную сыворотку относят к 3-й классификационной группе или группе выраженных отклонений (лица с высоким риском быстрой прогрессии основного заболевания и/или его осложнений),

г) вероятность прогрессии СД-1 пропорциональна степени отклонений от нормы в содержании ауто-АТ к инсулину,

д) вероятность прогрессии СД-2 пропорциональна степени отклонений от нормы в содержании ауто-АТ к инсулиновым рецепторам, выявляемым по реакции в лунках с адсорбированными антиинсулиновыми антителами (идиотипическими) или их фрагментами,

е) вероятность прогрессии диабетической нейропатии пропорциональна степени отклонений от нормы в содержании антител, перекрестно реагирующих как с инсулином, так и с фактором роста нервов, выявляемым по реакции в лунках с адсорбированными анти-антиинсулиновыми антителами (антиидиотипическими) или их фрагментами,

ж) вероятность прогрессии диабетической ангиопатии пропорциональна степени отклонений от нормы в содержании антител, реагирующих с антигеном ANCA,

з) по динамике изменений в содержании соответствующих ауто-АТ можно судить о позитивных или нарастании негативных тенденций в состоянии обследуемых, например, на фоне проводимого лечения.

Необходимо отметить, что выполнение анализов производится в условиях in vitro без какого-либо вреда для обследуемого.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Обследуемый 1