Патент на изобретение №2291425

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИММУННЫХ ПРЕПАРАТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии при испытании различных иммунных препаратов (например, иммуноглобулинов). Для этого в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим иммунным препаратом, а результат оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма по сравнению с контролем. Изобретение обеспечивает повышение скорости оценки антиинфекционной активности иммунных препаратов за счет приближения условий оценки к условиям макроорганизма. 2 табл.

Изобретение относится к области медицины, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии при испытании различных иммунных препаратов (например, иммуноглобулинов), а именно к оценке специфической активности иммунных препаратов.

Сущность способа сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводится совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим иммунным препаратом.

Антитела – это особый вид белков, называемых иммуноглобулинами (Ig), которые вырабатываются под влиянием антигенов и обладают способностью специфически связываться с ними. При этом антитела могут нейтрализовать токсины бактерий и вирусы (антитоксины и вируснейтрализующие антитела), осаждать растворимые антигены (преципитины), склеивать корпускулярные антигены (агглютинины), повышать фагоцитарную активность лейкоцитов (опсонины), связывать антигены, не вызывая каких-либо видимых реакций (блокирующие антитела), совместно с комплементом лизировать бактерии и другие клетки, например эритроциты (лизины).

На основании различий в молекулярной массе, химических свойствах и биологической функции выделяют пять основных классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

Цельная молекула иммуноглобулина (или его мономера у IgA и IgM) состоит из трех фрагментов: двух Fab-фрагментов, каждый из которых включает вариабельный участок тяжелой цепи и связанную с ним легкую цепь (на концах Fab-фрагментов находятся гипервариабельные участки, формирующие активные центры связывания антигенов), и одного Fc-фрагмента, состоящего из двух константных участков тяжелых цепей.

Аналогом предлагаемого способа является система комплексного исследования функциональной активности фагоцитирующих клеток периферической крови, позволяющая тестировать параметры, изменение которых может свидетельствовать о нарушении толерантности к инфекции. Начальным этапом взаимодействия фагоцита с антигеном является движение фагоцитов, стимулом для которого служат хемоаттрактанты. Затем наступает этап адгезии, за который отвечают поверхностные рецепторы: селектины и интегрины (CD18, CD11a, CD11b, CD11с, CD62L, CD62E), которые определяются с помощью моноклональных антител (MAT) методом иммунофлюоресценции.

Определение следующей стадии поглощения должно входить в оценку фагоцитарного индекса. Для изучения поглощения используют дрожжи, латексные частицы, S.aureus, E.coli или Candida albicans. Подсчет в окрашенных препаратах числа частиц, поглощенных нейтрофилами, осуществляется с помощью светового, люминисцентного микроскопа, проточного цитометра. Поглотительную способность оценивают по фагоцитарной активности и фагоцитарному индексу. Поглотительная способность нарушается при ряде острых и хронических инфекционных заболеваний, аутоиммунных процессах. Врожденные изменения этой стадии неизвестны. Стадия киллинга и расщепления осуществляется с помощью кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов. В первом случае происходит окисление кислорода НАДФ-H-оксидазной системой, в результате чего образуются активные формы кислорода, обладающие сильным микробоцидным действием, и их идентификация представляет важное звено функциональной активности фагоцитарных клеток.

Ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемого способа является метод определения активности естественных киллеров (NK), который проводят с помощью капиллярного теста, информативность которого возрастает при одновременном учете количества лимфоцитов с СD16-маркером. Принцип метода заключается в сокультивировании исследуемых клеток и клеток-мишеней в плоском капилляре с трипановым синим. После инкубации учитываются окрашенные клетки-мишени, что соответствует % спонтанной цитотоксичности. Показатель активности NK-клеток у доноров составляет 15%, хотя коэффициент вариации колеблется от 10% до 23% /1/.

Вышеизложенные аналоги и прототип предлагаемого изобретения не свидетельствуют о прямой антиинфекционной активности иммуноглобулинов, трудоемки, длительны (занимают от 24 до 72 часов); все эти тесты проводятся строго in vitro, и их условия далеки от условий макроорганизма.

Указанные методы не учитывают особенности биологии патогенных бактерий, которая свидетельствует о том, что способность вызывать инфекционные заболевания формировалась у патогенных микроорганизмов в направлении приобретения функций, позволяющих им проникать в организм хозяина, противостоять его защитным системам, а также вызывать нарушения деятельности физиологически важных систем. Факторы патогенности с инвазивной функцией и функцией защиты от фагоцитоза можно объединить в одну группу факторов, обеспечивающих развитие начальной, часто клинически не выраженной стадии инфекционного процесса. К другой группе факторов патогенности можно отнести биологически активные вещества (токсиканты), обуславливающие синдром заболевания с выраженной клинической картиной и возможную смерть хозяина 17.1.

Техническим результатом изобретения является повышение скорости оценки антиинфекционной активности иммунных препаратов за счет приближения условий оценки к условиям макроорганизма.

Результат изобретения достигается за счет того, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 часов тест-штамма микроорганизма с соответствующим иммунным препаратом (например, иммуноглобулином), а результат оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма по сравнению с контролем.

Способ осуществляется следующим образом.

Из пробирок Лейтона на покровное стекло с монослоем кожно-мышечных (ФКЭЧ) или легочных фибробластов (ФЛЭЧ) эмбриона человека, полученным по /3/, сливают ростовую среду и добавляют 1,8 мл иммунного препарата и 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в дозе 10 КОЕ/мл, получая конечную концентрацию тест-штамма 10 КОЕ/мл. Пробирки инкубируют 2 часа при 37°С, затем клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий многократной сменой среды Игла, фиксируют 96° этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимза и исследуют микроскопически, определяя степень инфицированности монослоя сравнительно с контролем. В контрольной пробирке проводят совместное инкубирование 1,8 мл поддерживающей среды Игла с 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в конечной дозе 10⁸ КОЕ/мл. Интенсивность процесса адгезии оценивают по следующим показателям: 1) индекс адгезии (ИА) выражают средним числом бактериальных клеток на одной эукариотической клетке; 2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%); 3) обсемененность 100 клеток монослоя – микробную нагрузку (МН) – определяют по формуле МН=ИА × ПК%. Процент адгезии микроба определяют по показателю микробной нагрузки относительно контроля, принимаемого за 100%.

Исследования по оценке антиинфекционной активности иммунных препаратов проводили на примере иммуноглобулина человеческого нормального и пентаглобина.

Пример 1. Определение специфической антиинфекционной активности коммерческих препаратов иммуноглобулина человеческого нормального и пентаглобина в отношении тест-штамма S.aureus 209 на культуре клеток (КК) ФКЭЧ. Среда для культивирования тест-культур микроорганизмов – мясо-пептонный бульон, для культивирования фибробластов – питательная среда Игла.

В пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ помещали 1,8 мл иммуноглобулина нормального 20 мг/мл или пентаглобина 50 г/л и 0,2 мл суточной тест-культуры микроорганизма в дозе 10⁹ КОЕ/мл для получения конечной концентрации тест-штамма 10⁸ КОЕ/мл. В качестве контроля использовали смесь 1,8 мл питательной среды Игла с 0,2 мл суточной тест-культуры микроорганизма в той же дозе, помещенную в пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ. Пробирки инкубировали 2 часа при 37°С, затем клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов многократной сменой среды Игла, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент адгезии микроба по сравнению с соответствующим контролем без иммуноглобулинов по показателю микробной нагрузки (таблица 1).

Как видно из данных таблицы 1, процент адгезии тест-штамма стафилококка золотистого достоверно снизился относительно контроля на 95,5% в присутствии иммуноглобулина нормального и на 97,5% в присутствии пентаглобина.

Предлагаемое изобретение позволяет также оценить антиинфекционную активность иммунных препаратов в присутствии бактериального фактора патогенности (токсиканта), например, белка А стафилококка.

Пример 2. Определение специфической антиинфекционной активности коммерческих препаратов иммуноглобулина человеческого нормального и пентаглобина в отношении тест-штамма S.aureus 209 на культуре клеток (КК) ФКЭЧ в присутствии токсиканта – белка А очищенного аффиннохроматографического сухого. Среда для культивирования тест-культур микроорганизмов – мясо-пептонный бульон, для культивирования фибробластов – питательная среда Игла.

В пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ помещали 0,9 мл иммуноглобулина нормального 20 мг/мл или пентаглобина 50 г/л, 0,2 мл суточной тест-культуры S.aureus в дозе 10⁹ КОЕ/мл для получения конечной концентрации тест-штамма 10⁸ КОЕ/мл и 0,9 мл белка А в дозе 2 г/л. В качестве контроля использовали смесь 0,9 мл питательной среды Игла, 0,2 мл суточной тест-культуры микроорганизма в той же дозе и 0,9 мл белка А 2 г/л, помещенную в пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ. Пробирки инкубировали 2 часа при 37°С, затем клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов многократной сменой среды Игла, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент адгезии микроба по сравнению с соответствующим контролем без иммуноглобулинов по показателю микробной нагрузки (таблица 2).

Как видно из данных таблицы 2, присутствие бактериального токсиканта – белка А стафилококка – полностью подавляло антиинфекционную активность иммуноглобулина нормального и не влияло на активность пентаглобина. Процент снижения адгезии тест-штамма микроорганизма в присутствии пентаглобина в данном случае составил 96,9%.

Данный пример подтверждает эффективность способа оценки различной антиинфекционной активности иммунных препаратов, уровень которой может зависеть от присутствия, кроме патогенной флоры, бактериальных токсикантов.

Литература

1. Иммунодиагностика и иммунокоррекция в клинической практике. – Под ред. И.Д.Столярова. – СПб: Сотис, 1999. – 176 с.

2. Ю.В.Езенчук. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. – М.: Наука, 1977. -215 с.

3. К.Б.Грабовская, А.А.Тотолян. Журн. Микробиол. – 1977. – №2. – с.32-36.

Формула изобретения

Способ оценки специфической активности иммунных препаратов, отличающийся тем, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 ч тест-штамма микроорганизма с иммунным препаратом, а результат оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма по сравнению с контролем.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 15.04.2007

Извещение опубликовано: 20.07.2008 БИ: 20/2008

NF4A – Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 27.02.2010

Извещение опубликовано: 27.02.2010 БИ: 06/2010