Патент на изобретение №2290178

(54) СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к профилактической онкологии. Изобретение заключается в том, что предлагаемое средство содержит из класса нестероидных противовоспалительных препаратов, ассоциат 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты, инозин и N-метилглюкозамин. Ассоциат при пероральном применении эффективно тормозит возникновение и развитие злокачественных и доброкачественных опухолей головного мозга, спинного мозга, почек, молочной железы, пищевода, преджелудка, шейки матки и влагалища, индуцированных химическими канцерогенами у лабораторных животных. Изобретение обеспечивает получение препарата, обладающего более выраженной антиканцерогенной активностью и значительно меньшим токсическим ульцерогенным действием. 5 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к профилактической онкологии.

Однако применение НПВП для профилактики рака сдерживает серьезная токсичность. Недостатком НПВП является их способность ингибировать активность как циклооксигеназы-2, так и циклооксигеназы-1, что вызывает диспепсию, язвы желудка, двенадцатиперстной кишки и других отделов желудочно-кишечного тракта, желудочно-кишечные кровотечения и перфорации [IARC Working Group on the Evaluation of Cancer Preventive Agents. Non-steroidal Anti-inflammatory Drugs. – IARC Handbooks of Cancer Prevention. – Vol.1. – Lyon: International Agency for Research on Cancer, 1997. – 202 ps]. Это не позволяет назначать НПВП в течение длительного времени с целью профилактики рака.

Профилактическая онкология нуждается в новых НПВП, обладающих эффективной способностью тормозить возникновение и развитие злокачественных опухолей, но лишенных вышеназванного недостатка. Целью изобретения является создание нового средства для профилактики рака из класса НПВП, обладающего выраженным антиканцерогенным (онкопрофилактическим) действием и не имеющего значимого токсического ульцерогенного действия на желудочно-кишечный тракт.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является лекарственный препарат из класса НПВП – ортофен (диклофенак, вольтарен). Химическое название ортофена – 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусная кислота (в виде натриевой соли), брутто-формула – C₁₄H₁₁Cl₂NO₂

Серьезным недостатком ортофена, как и у всех других НПВП, является способность вызывать язвы желудка, двенадцатиперстной кишки и других отделов желудочно-кишечного тракта, желудочно-кишечные кровоизлияния, кровотечения и перфорации [Регистр лекарственных средств России / Под ред. Г.Л.Вышковского, Ю.Ф.Крылова, Е.Г.Лобанова и др. – М.: РЛС-2003, 2003. – С.277-278], что не позволяет назначать данный препарат в течение длительного времени с целью профилактики рака.

Технический результат состоит в создании нового средства из класса НПВП для профилактики рака, обладающего выраженным антиканцерогенным действием и низкой токсичностью в отношении желудочно-кишечного тракта. Технический результат достигается тем, что в качестве средства для профилактики рака предложен новый малотоксичный НПВП, отличающийся тем, что он представляет из себя ассоциат 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты, инозина и N-метилглюкозамина (далее ассоциат) в соотношении 1:1:3. Составные части ассоциата: аналог основания нуклеиновой кислоты – инозин и производное глюкозамина – N-метилглюкозамин усиливают специфическую антиканцерогенную активность и уменьшают токсическое ульцерогенное действие 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты.

Заявляемое техническое решение по сравнению с ближайшим аналогом имеет отличительные существенные признаки, что позволяет это решение считать отвечающим условию патентоспособности – новизна. Анализ известных в науке и технике аналогичных технических решений показывает, что заявляемое средство для профилактики рака не обнаружено, и совокупность отличительных существенных признаков не известна. Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности – изобретательский уровень.

Ниже приведены примеры получения и использования в качестве средства для профилактики рака ассоциата 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты, инозина и N-метилглюкозамина в сравнении с аналогом – ортофеном (2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислотой (в виде натриевой соли).

Пример 1. Химический синтез ассоциата 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты, инозина и N-метилглюкозамина.

Реактивы для синтеза ассоциата получали от фирмы «Химмед», Москва. К раствору N-метилглюкозамина (5,85 г; 30 ммоль) в 200 мл воды при 60°С добавляли инозин (2,68 г; 10 ммоль) и 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусную кислоту (2,95 г; 10 ммоль). Полученный раствор упаривали в вакууме и твердый остаток высушивали 5 часов при 60°С в вакууме над Р₂O₅. Брутто формула – С₄₅Н₇₄Cl₂N₈O₂₂·3Н₂O. Выход продукта – 10,35 г (90%); точка плавления – 112-115°С. ИК-спектр (, см^-1): 1510 (С=С), 1710 (С=O), 2710 (), 3230 (NH), 3310 (ОН). ¹Н ЯМР-спектр (ДМСО-₆, , м.д.): 2,29 (NCH₃), 2,67 (CH₂), 3,2-4,6 (СН), 5,80 (Н-1′ инозина), 6,2-7,5 (фенил), 8,0 и 8,24 (Н-2, Н-8 инозина).

Найдено: С 44,5; Н 6,1; N 8,4%. С₄₅Н₇₄Cl₂N₈O₂₂·3Н₂O.

Вычислено: С 44,8; Н 6,7; N 9,3%.

Погибших и забитых в терминальном состоянии или по окончании экспериментов животных подвергали полной аутопсии. Животных забивали парами эфира. Органы с опухолями фиксировали в 10% растворе формалина. Гистологическую обработку тканей производили по стандартной методике с окраской гематоксилин/эозином. Патоморфологический анализ материала осуществляли при световой микроскопии. Патоморфологическую диагностику опухолей крыс и мышей проводили согласно классификации Международного агентства по изучению рака.

где И – % ингибирования, МО – среднее число опухолей по отношению ко всем животным в опытной группе, МК – среднее число опухолей по отношению ко всем животным в контрольной группе. Вычисленный по данной формуле % ингибирования канцерогенеза является интегральным показателем снижения частоты и множественности опухолей при воздействии тестируемого препарата. Для каждого препарата рассчитывали коэффициент ингибирования канцерогенеза как среднюю арифметическую величину процентов ингибирования отдельных локализаций опухолей. Для расчета коэффициента ингибирования брали только статистически достоверные величины изменения показателей развития опухолей в органах-мишенях и спонтанных по сравнению с контрольными. Расчет производился по формуле:

где К – коэффициент ингибирования канцерогенеза; И₁, И₂, И₃ – % ингибирования канцерогенеза отдельной локализации опухолей; N – общее число изученных локализаций опухолей для данного вещества, в которых было статистически достоверное торможение канцерогенеза по сравнению с контролем; – сумма всех вариантов в пределах от первой до n-й величины. Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми статистическими методами с использованием критериев ², точного метода Фишера, t (Стьюдента) на персональном компьютере IBM, с использованием программ Statistica, Mstat и Excel.

Пример 2. Применение ассоциата 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты, инозина и N-метилглюкозамина для профилактики опухолей нервной системы и почек.

Самкам крыс на 21-й день беременности вводили однократно внутривенно ЭНМ в физиологическом растворе в дозе 75 мг/кг массы тела. В контрольной группе крыс-потомков дополнительным воздействиям не подвергали. В опытных группах крысам-потомкам давали ортофен или ассоциат с питьевой водой в концентрации соответственно 20 и 100 мг/л. Препараты предварительно растворяли в небольшом количестве этанола. Препараты давали ежедневно до конца опыта. При этом среднее суточное потребление 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты составляло в обеих группах по 1 мг/кг массы тела. Крыс-потомков забивали через 12 месяцев после рождения. Ортофен и ассоциат тормозили развитие опухолей нервной системы и почек, индуцированных ЭНМ у крыс (табл.1)

Таблица 1. Влияние ортофена и ассоциата на развитие опухолей нервной системы и почек
Показатель	Группа
	ЭНМ-контроль	ЭНМ + ортофен	ЭНМ + ассоциат
N	53	29	41
Частота и множественность опухолей
Всего	53(100%); 2,75±0,18	23(793%)*1; 1,55±0,19*2	30(732%)*7; 1,39±0,2*8
Головной мозгa	43(81,1%); 1,45±0,12	17(58,6%)*3; 0,83±0,09*4	23(56,1%)*9; 0,8±0,1*10
Спинной мозга	19(35,8%); 0,58±0,09	5(17,2%)*5; 0,17±0,05*6	7(17,1%)*11; 0,17±0,04*12
ПНб	15(28,3%); 03±0,06	6(20,7%); 0,21±0,05	11(26,8%); 0,29±0,05
Почкив	17(32,1%); 034±0,06	9(31%); 0,34±0,09	5(12,2%)*13; 0,12±0,04*14
Прочие	3(5,7%)г; 0,08±0,06	0	0
ПН – периферические нервы. По гистологической структуре: а в большинстве случаев олигодендроглиомы, смешанные олигоастроцитомы, астроцитомы, редко эпендимомы, менингиомы и глиобластомы; б развивались чаще всего в тройничных нервах, редко – в плечевом и люмбосакральном нервных сплетениях, спинно-мозговых корешках и других тканях, в большинстве случаев злокачественные невриномы, иногда смешанные злокачественные опухоли с саркоматозным и нейрогенным компонентом; в практически все опухоли мезенхимальные, в единичных случаях эпителиальные аденокарциномы; г аденокарцинома молочной железы, гранулезоклеточная опухоль яичников, аденома гипофиза, плоскоклеточный рак влагалища. * Разница с контролем статистически достоверна: *1*3*7*9*11 2=4,1-16,1, р<0,05-0,001; *5 и *13 р=0,043 и 0,015 по точному методу Фишера; *2*4*6*8*10*12*14 t=3,05-5,05, р<0,01-0,001.

Ортофен по сравнению с контролем статистически достоверно снижал общую частоту и множественность опухолей соответственно на 20,7 и 43,6%, головного мозга – на 22,5 и 42,8%, спинного мозга – на 18,6 и 70,7%. Ассоциат по сравнению с контролем статистически достоверно снижал общую частоту и множественность опухолей соответственно на 26,8 и 49,5%, головного мозга – на 25 и 44,8%, спинного мозга – на 18,7 и 70,7%, почек – на 19,9 и 64,7% (табл.1).

Пример 3. Применение ассоциата 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты, инозина и N-метилглюкозамина для профилактики опухолей молочной железы.

Самкам крыс в возрасте 3 месяца и начальным весом 200-230 г произвели интрамаммарные инъекции МНМ в ткань всех 12 молочных желез, однократно, по 1 мг МНМ в 0,1 мл физиологического раствора на железу. В контрольной группе крыс дополнительным воздействиям не подвергали. В опытных группах крысам ежедневно давали ортофен или ассоциат, которые предварительно измельчали, смешивали с крахмалом, а затем добавляли в корм в концентрации соответственно 25 или 125 мг/кг. При этом среднее суточное потребление 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты составляло в обеих группах по 3,75 мг/кг массы тела. Крыс забивали через 6 месяцев после воздействия МНМ. Ортофен и ассоциат тормозили развитие опухолей молочной железы, индуцированных МНМ у крыс (табл.2).

Таблица 2 Влияние ортофена и индометацина на развитие опухолей молочной железы
Группа	N	Частота, количество и множественность опухолей
		Молочная железаа	Прочиеб
МНМ-контроль	25	19(76%); 34; 1,36±0,21	3(12%); 3; 0,12±0,04
МНМ + ортофен	17	8(47%)*1; 18; 1,06±0,25	1(5,9%);1; 0,06±0,06
МНМ + ассоциат	25	10(40%)*2; 18; 0,72±0,15*3	1(4%);1; 0,04±0,04
По гистологической структуре: а в большинстве случаев аденокарциномы, реже фиброаденомы; б аденомы гипофиза, папилломатоз преджелудка. * Разница с контролем статистически достоверна: *1 p=0,043 по точному методу Фишера; *2 2=6,6, p<0,05; t=2,47, p<0,05.

По сравнению с контролем ортофен статистически достоверно снижал частоту опухолей молочной железы на 29%, ассоциат – частоту и множественность опухолей молочной железы на 36 и 41,7 (табл.2).

Пример 4. Применение ассоциата 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты, инозина и N-метилглюкозамина для профилактики опухолей пищевода.

Крысам-самцам с начальным весом 120-130 г вводили внутрижелудочно зондом ЭЭНС, 5 раз в неделю в ежедневной дозе 100 мг/кг массы тела в течение 8 недель. В контрольной группе крыс дополнительным воздействием не подвергали. В опытных группах крысам ежедневно давали ортофен или ассоциат с кормом по той же схеме, что в примере 3. Крыс зыбивали через 40 недель от начала введения ЭЭНС. Ортофен и ассоциат тормозили развитие опухолей пищевода и преджелудка, индуцированных ЭЭНС у крыс (табл.3).

Таблица 3
Влияние ортофена и ассоциата на развитие опухолей пищевода и преджелудка
Группа	N	Частота, количество и множественность опухолей
		Всего	Пищевод а	Преджелудок б
ЭЭНС	41	40(97,6%); 209;	36(87,8%); 151	20(48,8%); 57
		5,1±0,5	3,68±0,4	1,39±0,29
ЭЭНС + ортофен	25	16(64%)*1; 47; 1,88±0,77*2	14(56%)*3; 35 1,4±0,44*4	4(16%)*5; 12 0,48±0,27*6
ЭЭНС + ассоциат	32	18(56,2%)*7; 53 1,65±0,38*8	16(50%)*9; 42 1,31±0,3*10	5(15,6%)*11; 11 0,34±0,16*12
По гистологическому типу: а в большинстве случаев папилломы, в контрольной группе также единичные плоскоклеточные карциномы; б папилломы. * Разница с контролем статистически достоверна: *1*3*7*9 2=8,5-18,7, р<0,01-0,001; *5 и *11 р=0,005 и 0,0023 по точному методу Фишера; *2*4*6*8*10*12 t=2,29-5,49, р<0,05-0,001.

По сравнению с контролем ортофен статистически достоверно уменьшал частоту и множественность всех опухолей на 33,6 и 63,1%, пищевода – на 31,8 и 62%, преджелудка – на 32,8 и 65,5%. Ассоциат по сравнению с контролем статистически достоверно уменьшал частоту и множественность всех опухолей на 41,4 и 67,6%, пищевода – на 37,8 и 64,4%, преджелудка – на 33,2 и 75,5%. При воздействии ортофена и индометацина вообще не развивались карциномы (табл.3).

Пример 5. Применение ассоциата 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты, инозина и N-метилглюкозамина для профилактики опухолей шейки матки и влагалища.

Самкам мышей с начальным весом 20-22 г вводили внутривлагалищно 0,1% раствор ДМБА в триэтиленгликоле на полиуретановых тампонах, 2 раза в неделю в течение 8 недель. В контрольной группе мышей дополнительным воздействиям не подвергали. В опытных группах мышам давали ортофен или ассоциат с питьевой водой по той же схеме, что в примере 2. При этом среднее суточное потребление 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты составляло в обеих группах по 3 мг/кг массы тела. Мышей забивали через 9 месяцев от начала введения ДМБА. Ортофен и ассоциат тормозили развитие опухолей шейки матки и влагалища, индуцированных ДМБА у мышей (табл.4).

Таблица 4. Влияние ортофена и индометацина на развитие опухолей шейки матки и влагалища
Группа	N	Частота, количество и множественность опухолей
		Шейка матки и влагалище а	Прочиеб
ДМБА-контроль	61	41(67,2%); 41; 0,67±0,06	10(16,4%); 12; 0,2±0,05
ДМБА + ортофен	30	11(36,7%)*1; 11; 0,37±0,09*2	6(20%); 6; 0,2±0,07
ДМБА + ассоциат	35	12(34,3%)*3; 12; 0,34±0,09*4	5(14,3%); 5; 0,14±0,06
По гистологической структуре: а в большинстве случаев плоскоклеточные карциномы, в единичных случаях – аденосквамозные карциномы и аденокарциномы; б аденокарциномы молочной железы, аденомы легких, папилломы преджелудка, папилломы кожи. * Разница с контролем статистически достоверна: *1 2=7,6; *2 1=2,77; *3 2=9,7; *4 t=3,05; р<0,01.

По сравнению с контролем ортофен статистически достоверно уменьшал частоту и множественность опухолей шейки матки и влагалища соответственно на 30,5 и 44,8%; ассоциат – на 32,9 и 49,3% (табл.4).

Пример 6. Оценка токсического ульцерогенного действия ассоциата 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты, инозина и N-метилглюкозамина.

Для оценки ульцерогенного действия препаратов у большей части павших или забитых по окончании экспериментов крыс и мышей раскрывали желудок и кишечник и регистрировали наличие язв на слизистой оболочке. Ортофен обладал выраженным токсическим действием: вызывал язвы желудочно-кишечного тракта. Ассоциат практически не обладал ульцерогенным действием (табл.5).

Таблица 5. Влияние ортофена и ассоциата на развитие язв желудочно-кишечного тракта
Группа	N	Число животных с язвами	2 и p
Контроль	108	4(3,7%)
Ортофен	92	30(32,6%)	с контролем: 29,4; <0,001
Ассоциат	105	7(6,7%)	с ортофеном: 21,6; <0,001

В контрольных группах у единичных животных обнаружены язвы на слизистой оболочке желудка и кишечника. Ортофен статистически достоверно по сравнению с контролем увеличивал число животных с язвами на 28,9%. У животных, получавших ассоциат, частота язв практически приближалась к контрольному показателю и была статистически достоверно меньше на 25,9% по сравнению с животными, получавшими ортофен (табл.5). Из 30 животных, у которых в результате токсического действия ортофена развились язвы желудочно-кишечного тракта, 10(33,3%) погибли от прободения язвы и перитонита. В группах животных, получавших ассоциат, случаев гибели от прободения язвы не зарегистрировано.

Таким образом, препарат сравнения ортофен тормозил возникновение и развитие злокачественных и доброкачественных опухолей головного мозга (% ингибирования – 42,8), спинного мозга (70,7%), молочной железы (22,1%), пищевода (62%), преджелудка (65,5%), шейки матки и влагалища (44,8%), индуцированных химическими канцерогенами у животных; коэффициент ингибирования канцерогенеза составил 51,3%. Ассоциат тормозил возникновение и развитие злокачественных и доброкачественных опухолей головного мозга (44,8%), спинного мозга (70,7%), почек (64,7%), молочной железы (47,1%), пищевода (64,4%), преджелудка (75,5%), шейки матки и влагалища (49,3%), индуцированных химическими канцерогенами у животных; коэффициент ингибирования канцерогенеза составил 59,5%. Следовательно, антиканцерогенное действие ассоциата было более выраженное по сравнению с ближайшим аналогом – ортофеном. С другой стороны, ассоциат выгодно отличается от ближайшего аналога ортофена значительно более слабым токсическим ульцерогенным действием.

Предлагаемое для профилактики рака средство ассоциат 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты, инозина и N-метилглюкозамина обеспечивает следующие преимущества по сравнению с наиболее близким аналогом ортофеном и другими НПВП: 1) более выраженное антиканцерогенное (онкопрофилактическое) действие; 2) менее выраженные токсические ульцерогенные эффекты на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта.

Формула изобретения

Средство для профилактики рака на основе нестероидного противовоспалительного препарата, отличающееся тем, что использован ассоциат 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]бензолуксусной кислоты, инозина и N-метилглюкозамина в соотношении 1:1:3.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 30.06.2007

Извещение опубликовано: 20.02.2009 БИ: 05/2009