Патент на изобретение №2289423

(54) ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ, ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННОЙ, АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ И ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается антитромботического, антикоагулянтного, фибриндеполимеризационного и фибринолитического средства, содержащего пептид формулы Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. Заявленное средство обладает высокой активностью и эффективностью по сравнению с известными средствами. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, к средствам, обладающим антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной, антитромботической и фибринолитической активностью.

Однако он имеет следующие недостатки:

1) не обладает антитромбоцитарными свойствами,

2) не обладает фибринолитическим действием,

3) при передозировке высокомолекулярные фракции могут вызвать нежелательные побочные явления кровоточивости.

Он имеет следующие недостатки:

1) не имеет антикоагулянтных эффектов,

2) не имеет антитромботического действия,

3) не имеет фибриндеполимеризационной активности,

4) проявляет протеолитическое действие.

Однако препарат имеет следующие недостатки:

1) не обнаруживает антикоагулянтной активности,

2) имеет побочные эффекты – кровоточивость со стороны желудочно-кишечного тракта.

Однако они имеют следующие недостатки:

1) имеют слабую антикоагулянтную активность,

2) не проявляют антитромбоцитарного эффекта,

3) кратковременность действия в организме,

4) их нельзя использовать в клинике, так как при их распаде в кровотоке увеличится уровень свертывающих факторов – фибриногена, тромбина.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является расширение спектра действия средств на процессы свертывания крови.

Указанный технический результат достигается тем, что пептид формулы Pro-Arg-Pro-Gly-Pro рекомендуют в качестве средства с антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной, антитромботической и фибринолитической активностями.

Пример 1. Синтез пентапептида Pro-Arg-Pro-Glv-Pro.

Синтез пептида осуществляли классическими методами пептидной химии с использованием природных L-аминокислот. Сначала получали трипептид Pro-Gly-Pro, а затем ступенчатым наращиванием пептидной цепи с N-конца получали пентапептид. Упаривание растворов проводили на вакуумном испарителе при 40°С. Температуры плавления, определенные на столике для плавления Boetiys, даны без исправления. Индивидуальность полученных соединений проверяли с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем фирмы Silufol. Вещества обнаруживали в УФ-свете с помощью нингидрина, о-толидина в среде хлора. Удельное вращение определяли на поляриметре марки “А1-ЕПО”. Элементный анализ (C, H, N) удовлетворительно совпал с теоретическим. Проверку гомогенности пептида проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Все растворители соответствующим образом абсолютировали.

Приведены хроматографические подвижности (Rf) в системах растворителей: бутанол: уксусная кислота: вода (4:1:1) – (1); хлороформ: метанол: аммиак (6:4:1) – (2); ацетон: бензол: уксусная кислота (50:100:1) – (3); хлороформ: метанол (9:1) – (4); гексан: ацетон (3:2) – (5); бутанол: уксусная кислота: пиридин: вода (30:6:20:24) – (6); хлороформ: метанол (14:1) – (7).

Принятые сокращения:

Вос – трет-бутилоксикарбонил

ДМФА – диметилформамид

ДЦГК – дициклогексилкарбодиимид ТЭА – триэтиламин

ДЦМ – дигиклогексилмочевина

ОБТ – оксибензотриазол

OBzl – бензиловый эфир

OEt – этиловый эфир

ТГФ – тетрагидрофуран

ТСХ – тонкослойная хроматография

ТФА – трифторацетат

ТФУ – трифторуксусная кислота

I. Boc-Pro-Gly-OEt. Вос-Pro 8,3 г (38,45 ммоль) растворяли в 50 мл CH₂Cl₂, охлаждали до +5°С, добавляли 38,45 ммоль (5,38 мл) ТЭА. Реакционную смесь охлаждали до -25÷-30°С. При этой температуре из пипетки прибавляли 38,45 ммоль (4,84 мл) изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты. Температуру реакционной смеси удерживали в интервале -18÷-20°С 20 минут. Одновременно готовили раствор 5,9 г (42,3 ммоль) избыток 1,1 HCl-H-Gly-OEt в 75 мл хлороформа, содержащего 5,92 мл ТЭА. Раствор охлаждали до -25°С и после образования смешенного ангидрида в первой колбе ее содержимое приливали сразу же к раствору эфира. Реакционную смесь выдерживали при температуре -10°С 1 час и затем при температуре +4°С 12 часов при перемешивании на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали, добавляли 250 мл этилацетата, раствор этилацетата промывали 3 раза по 25 мл 0,1н. HCl, 3 раза по 25 мл Н₂О, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, фильтровали и упаривали. Остаток высушивали в вакууме над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход – 10,2 г (30,3 ммоль), 78,83%.

Rf – 0,5(3); 0,862 (4).

II. Boc-Pro-Gly-N₂H₃. Boc-Pro-Gly-OEt 10,2 г (30,3 ммоль) растворяли в 80 мл абсолютного метанола, добавляли 4-кратный избыток гидразин-гидрата 5,88 мл (121,2 ммоль). Перемешивали 12 часов на магнитной мешалке при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, два раза упаривали с эфиром, остаток заливали эфиром (5 мл) и оставляли в холодильнике на ночь (для лучшей кристаллизации добавляли затравку). Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром, сушили в эксикаторе.

Выход – 6,9 г (20,79 ммоль), 68,62%

Т.пл. 98-100°С

Rf – 0,284 (3); 0,474 (4); 0,189 (5).

III. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl.

К охлажденному до -20°С раствору Вос-Pro-Gly-N₂Н₃ 4,7 г (14,6 ммоль) в 40 мл ДМФА добавляли 58,4 ммоль (4-кратный избыток) раствора хлористого водорода в этилацетате и сразу же 1,73 мл (14,6 ммоль) трет-буталнитрита, реакционную смесь перемешивали 30 минут при -5°С. Реакционную смесь охлаждали до -40°С и добавляли охлажденный до -10°С раствор 8,2 мл (58,4 ммоль) ТЭА в 4 мл ДМФА; когда температура реакционной смеси повышалась до -20°С, добавляли 3,7 г (15,3 ммоль) избыток 1,05 HCl-H-Pro-OBzl в 20 мл ДМФА и 2,14 мл ТЭА. Выдерживали при 4°С 24 часа, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в 200 мл этилацетата и промывали 2 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 5% раствором NaHCO₃, 3 раза по 20 мл Н₂О. Этилацетатный слой высушивали над MgSO₄. Упаривали, остаток заливали небольшим количеством эфира (10 мл). Оставляли в холодильнике. Для лучшей кристаллизации продукта добавляли затравку. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре небольшим количеством эфира.

Сушили в эксикаторе.

Выход – 5,358 г (11,65 ммоль), 79,92%

Rf – 0,326 (3); 0,947 (4); 0,390 (5)

Т.пл. 125-126°С

[]_D ²²=-101,2° (с=0,85; СН₃ОН)

Элементный анализ: С 62,89(62,73); N 9,21(9,14); Н 7,52(7,24).

IV. ТФА-Н-Pro-Gly-Pro-OBzl. 5,358 г (11,65 ммоль) Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 29,13 мл хлористого метилена, добавляли 29,13 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над P₂O₅/KOH и парафином.

Выход – 4,63 г (9,7 ммоль), 98%

Rf – 0,043 (3); 0,247 (4); 0,018 (5).

V. Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl. 3,09 г (9,7 ммоль) Boc-Arg(NO₂) растворяли в 50 мл ТГФ и 10 мл ДМФА, добавляли 2,07 г (10,67 ммоль) ДЦГК, охлаждали до 0°С, перемешивали в течение 40 минут и добавляли раствор ТФА-H-Pro-Gly-Pro-OBzl в 50 мл ТГФ и 4,46 мл (9,7 ммоль) ТЭА. Перемешивали реакционную смесь в течение трех суток. Отфильтровывали осадок ДЦМ, упаривали раствор в вакууме, к остатку приливали раствор 200 мл гексана, при этом отделялся целевой продукт в виде масла, которое растворяли в 500 мл этилацетата и промывали 3 раза по 25 мл 0,1 н. HCl,3 раза по 25 мл Н₂О, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, фильтровали и упаривали. Остаток высушивали в вакууме над P₂O₅/KOH и парафином.

Выход 4,76 г (7,9 ммоль), 85%

Rf – 0,44(1); 0,8 (6)

Т пл. 108-110°С.

VI. TFA-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl. 4,76 г (7,9 ммоль) Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 20 мл хлористого метилена, добавляли 20 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂О₅/KOH и парафином. Выход количественный.

Rf – 0,16(1); 0,27 (6).

VII. Boc-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl. Boc-Pro 1,7 г (7,9 ммоль) растворяли в 20 мл ТГФ, добавляли 1,07 г (7,9 ммоль) ОБТ, охлаждали до 0°С и добавляли 1,8 г ДЦГК в 50 мл ТГФ. Через 40 мин к реакционной смеси добавляли раствор TFA-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl (7,9 ммоль) в 50 мл ТГФ и 1,1 мл (7,9 ммоль) ТЭА. Перемешивали 2 часа при 0°С и 2 суток при комнатной температуре, затем отфильтровывали ДЦМ, упаривали в вакууме, растворяли в 500 мл ЭА и обрабатывали аналогично Вос-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Выход 4,07 г (67,8%)

Rf – 0,42 (1); 0,72 (6); 0,31 (7)

Т пл. 147-148°C.

VIII. Boc-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. 4,07 г (6,5 ммоль) растворяли в 100 мл металона, добавляли 1 мл 1 н. соляной кислоты и 0,85 г катализатора -10% окись палладия на нейтральной окиси алюминия, гидрировали в токе сухого водорода при комнатной температуре и давлении 1 атм. в течение 6 часов. Затем катализатор отфильтровывали, промывали на фильтре метанолом. Объединенный фильтрат упаривали досуха. Остаток высаждали из абс. метанола эфиром.

Выход – 3,02 г 5,8 ммоль (89%)

Rf – 0,125 (1), 0,57 (2), 0,37 (6).

IX. Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. 3,02 г (5,8 ммоль) Boc-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro суспензировали в 10 мл 2 н. соляной кислоты в диоксане и выдерживали при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем добавляли сухой эфир, выпавший осадок промывали декантацией сухим эфиром. Переосаждали из абсолютного метанола эфиром.

Полученный осадок растворяли в 7,5 мл 30% этанола и наносили на колонку с Амберлистом А-21 (АсО^– – форма) для обмена хлористоводородной соли на ацетат.

Элюировали пептид 200 мл 30% этанола, упаривали в вакууме досуха и высаждали из метанола абс. эфиром.

Выход – 2,27 г (75%)

Rf – 0,2 (2); 0,1 (6)

Т пл. 180-185°С

[]_D ²⁰=-105° (с=0,4; СН₃СООН).

Аминокислотный состав по отношению к аргинину: Pro 2,78 (3); Gly 1,1 (1).

Результаты ВЭЖХ: Колонка Supercosil ABZ+Plus размер 4,6×250 мм; скорость потока 1 мл/мин; Элюент А: NH₄Н₂PO₄+Н₃PO₄ (50 mM. рН 2,8); элюент В: МеОН

Градиент: 0-20 мин (0-40%В); время выхода 10,13 мин.

Пример 2.

Берут 1 мг препарата формулы Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, растворяют в 2,5 мл физиологического раствора и вводят внутривенно в v.jugularis 5-ти лабораторным крысам по 0,5 мл (200 мкг) на 200 г массы тела. Контрольным животным тем же способом вводят 0,85% раствор NaCl в дозе 0,5 мл на 200 г массы тела. Через 10 мин берут кровь и центрифугируют ее при 1000 об/мин в течение 5 мин для получения богатой тромбоцитами плазмы (для анализа агрегации тромбоцитов), затем дополнительно центрифугируют кровь в течение 10 мин при 2000 об/мин и получают плазму, бедную тромбоцитами.

В результате анализа параметров гемостаза обнаруживают следующее.

В богатой тромбоцитами плазме агрегация тромбоцитов в опытных пробах составляла 93%, в то время как в контроле – 100%. В бедной тромбоцитами плазме обнаружено увеличение общей фибринолитической активности в 1,6 раза, антикоагулянтной активности в 1,4 раза, фибриндеполимеризационной активности в 1,8 раз по сравнению с контролем (физиологическим раствором).

Пример 3.

Берут 1 мг препарата пептида Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, растворяют в 2,5 мл физиологического раствора NaCl и вводят интраназально в течение 5 дней через каждые 24 часа 5-ти лабораторным крысам по 0,5 мл на 200 г массы тела. Контрольным животным тем же способом вводят 0,85% раствор NaCl. Через 5 дней после последнего введения берут кровь из v.jugularis и проводят ее центрифугирование при 2000 об/мин в течение 10 мин для получения плазмы, бедной тромбоцитами. Затем в изолированном зажимами участке v.jugularis (стаз) с помощью тромбина вызывают образование тромба и определяют через 1 час антитромботический эффект препарата.

В бедной тромбоцитами плазме обнаруживаю г увеличение общей фибринолитической активности за счет увеличения активности активатора плазминогена в 2 раза, антикоагулянтной активности в 1,5 раза, фибриндеполимеризационной активности в 2 раза по сравнению с контролем (физиологическим раствором). Препарат селанка проявлял высокий антитромботический эффект превышающий антитромботические свойства плазмы крови здоровых крыс в 5,6 раза: если в контроле вес тромбов составлял 1,4 мг, то в опыте – лишь 0,27 мг.

Таким образом, новый пептид Pro-Arg-Pro-Gly-Pro обладает широким спектром действия на процесс свертывания крови.

В таблице представлены данные, свидетельствующие о преимуществах заявленного пептида Pro-Arg-Pro-Gly-Pro по сравнению с эталонными препаратами комплекса гепарин-фибриноген и три- и тетрапептидами (Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly).

Таким образом, из таблицы видно, что заявленный пептид Pro-Arg-Pro-Gly-Pro имеет преимущества перед препаратами комплекса фибриноген-гепарин и пептидами Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly по степени увеличения антикоагулянтной, фибринолитической и антитромбоцитарной активности в условиях in vitro; при внутривенном введении антикоагулянтная, фибриндеполимеризационная, фибринолитическая активности заявленного пептида Pro-Arg-Pro-Gly-Pro превышают те же активности эталонного комплекса фибриноген-гепарин и тетрапептида Gly-Pro-Gly-Gly; при интраназальном введении антитромботические эффекты Pro-Arg-Pro-Gly-Pro превышают подобное действие тетрапептида Gly-Pro-Gly-Gly и соответствуют эффекту Pro-Gly-Pro. Комплекс фибриноген-гепарин при интраназальном введении не активен.

Формула изобретения

Пептид формулы Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, обладающий антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной, антитромботической и фибринолитической активностями.