Патент на изобретение №2289135

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ И БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности пульмонологии, и касается дифференциальной диагностики хронической обструктивной болезни легких и бронхиальной астмы. Сущность способа заключается в исследовании разницы интенсивности флюоресценции (t) в условных единицах до и после обработки дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) клеток бронхиального эпителия рестриктазой HpaII и решении дискриминантного уравнения Д=2,439·t, и при величине Д, равной или больше 23,33, диагностируют хроническую обструктивную болезнь легких, а при величине Д меньше 23,33 диагностируют бронхиальную астму. Преимущество изобретения заключается в повышении точности диагностики.

Изобретение относится к медицине, в частности к пульмонологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких.

В научно-практической литературе известны способы дифференциальной диагностики хронической обструктивной болезни легких и бронхиальной астмы, основанные на характеристике воспаления и совокупности оценки клинических признаков течения болезни (Федеральная программа по хронической обструктивной болезни легких, М., 2004).

Прототипом избран способ дифференциальной диагностики хронической обструктивной болезни легких и бронхиальной астмы, основанный на клинических признаках течения болезни (1).

Способ заключается в том, что у пациента исследуют признаки течения болезни (возраст начала болезни; курение в анамнезе; внелегочные проявления аллергии; симптомы (кашель и одышка); отягощенная наследственность по астме; бронхиальная обструкция; суточная вариабельность пиковой скорости выдоха (ПСВ); наличие легочного сердца; тип воспаления; эффективность глюкокортикоидной терапии, и по их степени выраженности проводят дифференциальный диагноз.

Известный способ имеет следующие недостатки:

1. Носит неконкретный характер.

2. Основан на оценке только качественных признаков болезни.

3. Не учитывает существенную роль эпигенетической модификации генома клеток бронхиального эпителия при бронхиальной астме.

Цель изобретения заключается в повышении точности дифференциальной диагностики хронической обструктивной болезни легких и бронхиальной астмы путем оценки эпигенетической модификации генома клеток бронхиального эпителия.

Цель достигается тем, что оценка эпигенетической модификации генома клеток бронхиального эпителия проводится на основании определения степени метилирования дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в клетках бронхиального эпителия, а дифференциальная диагностика осуществляется с помощью дискриминантного уравнения на основании измеренного значения метилирования ДНК клеток бронхиального эпителия.

Заявленный способ имеет следующие приемы:

а) по стандартной методике с помощью бронхофиброскопа под местной анестезией проводят биопсию из слизистой оболочки шпоры сегментарного бронха;

б) оценку состояния метилирования ДНК проводят по разнице интенсивности флюоресценции в условных единицах (у.е.) электрофоретических дорожек до и после обработки ее рестриктазой HpaII (2). Суть метода заключается в следующем: выделение геномной ДНК осуществляли из свежего и замороженного биопсийного материала путем обработки ферментом протеиназой К в течении 3 часов при 55°С и последующей фенол-хлороформенной экстракции.

Равные аликвоты геномной ДНК подвергали гидролизу ферментами рестрикции HpaII и MspI (“Сибэнзим”, Новосибирск) при оптимальной температуре три часа. Реакционная смесь в объеме 50 мкл включала 20 мкл образца геномной ДНК, 5 мкл 10Х буфера для рестрикции (“Сибэнзим”, Новосибирск) и 10 ед. акт. фермента.

Образец геномной ДНК и продукты рестрикции фракционировали в 0,8% агарозном геле с бромистым этидием при напряжении 90 В в течение 70-80 мин и визуализировали в ультрафиолетовом (УФ) свете.

Обработку результатов электрофореза и подсчет интенсивности флюоресценции дорожек осуществляли специализированной системой обработки изображений “ViTran”, OOO “Компания Биоком”, г.Москва.

в) дифференциальный диагноз проводят с помощью решения дискриминантного уравнения:

Д=2,439·t,

где Д – дискриминантная функция, граничное значение которой составляет 23,33;

t – разница интенсивности флюоресценции в условных единицах (у.е.) до и после обработки ДНК бронхиального эпителия рестриктазой HpaII.

При величине Д больше или равной 23,33 диагностируют хроническую обструктивную болезнь легких, а при величине Д меньше 23,33 диагностируют бронхиальную астму.

Ниже приводятся два примера использования заявленного способа.

Пример 1. X., 41 год, поступил с жалобами на приступообразный сухой кашель. Болен в течение двух лет. В анамнезе – у матери бронхиальная астма. В клиническом анализе крови количество эозинофилов 7%. Объем форсированного выдоха за 1 сек (ОФВ₁) составил 72,5% от должного. Бронходилатационная проба с беротеком положительная (прирост ОФВ₁ составил 17,3%). Суточная вариабельность пиковой скорости выдоха (ПСВ) составила 23%. При аллергологическом обследовании выявлена аллергия на домашнюю и библиотечную пыль. Уровень t (разница интенсивности флюоресценции) до и после обработки ДНК бронхиального эпителия рестриктазой HpaII составил 4 у.е. С целью дифференциальной диагностики бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких решено дискриминантное уравнение:

2,439·4=9,756,

дискриминантная функция меньше граничного значения 23,33, диагностирована бронхиальная астма.

Пример 2. К., 45 лет, поступил в клинику с жалобами на приступообразный сухой кашель. Болен в течение 8 лет. Наследственность по бронхиальной астме не отягощена. При аллергологическом обследовании аллергии не выявлено. В клиническом анализе крови количество эозинофилов 2%. ОФВ₁ составил 69% от должного. Бронходилатационная проба с беротеком отрицательная (прирост ОФВ₁ составил 9%). Суточная вариабельность ПСВ составила 11%. Уровень t составил 16 у.е. С целью дифференциальной диагностики хронической обструктивной болезни легких и бронхиальной астмы решено дискриминантное уравнение:

2,439·16=39,024,

дискриминантная функция больше граничного значения 23,33, диагностирована хроническая обструктивная болезнь легких.

Предлагаемый способ прошел клиническую апробацию в клинике Государственного учреждения Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН. С помощью способа проведен дифференциальный диагноз у 25 больных хронической обструктивной болезнью легких и бронхиальной астмой.

Результаты проверки заявленного способа показали его эффективность. Правильный диагноз определялся в 80% случаев.

Литература.

1. Федеральная программа по хронической обструктивной болезни легких. – М., 2004.

2. Айала Ф. Современная генетика / Ф.Айала, Дж.Кайгер. – М.: МИР, 1988. – Т.2. – С.227-228.

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики хронической обструктивной болезни легких и бронхиальной астмы, включающий определение эпигенетической модификации генома клеток бронхиального эпителия, отличающийся тем, что исследуют степень метилирования ДНК в клетках бронхиального эпителия по разнице интенсивности флюоресценции до и после обработки ее рестриктазой HpaII, решают дискриминантное уравнение

Д=2,439·t,

где t – разница интенсивности флюоресценции до и после обработки ДНК бронхиального эпителия рестриктазой HpaII в условных единицах,

и при величине Д, равной или больше 23,33, диагностируют хроническую обструктивную болезнь легких, а при величине Д меньше 23,33 диагностируют бронхиальную астму.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 16.04.2007

Извещение опубликовано: 20.07.2008 БИ: 20/2008