Патент на изобретение №2288736

(54) ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ, ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННОЙ, АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ И ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается антикоагулянтного, фибриндеполимеризационного, антитромбического и фибринолитического средства, содержащего пептид формулы Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. Заявленное средство обладает высокой активностью и эффективностью по сравнению с известными средствами. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, к средствам, обладающим антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной, антитромботической и фибринолитической активностью.

Однако он имеет следующие недостатки:

1) не обладает антитромбоцитарными свойствами,

2) не обладает фибринолитическим действием,

3) при передозировке высокомолекулярные фракции могут вызвать нежелательные побочные явления кровоточивости.

Он имеет следующие недостатки:

1) не имеет антикоагулянтных эффектов,

2) не имеет антитромботического действия,

3) не имеет фибриндеполимеризационной активности,

4) проявляет протеолитическое действие.

Однако препарат имеет следующие недостатки:

1) не обнаруживает антикоагулянтной активности,

2) имеет побочные эффекты – кровоточивость со стороны желудочно-кишечного тракта.

Однако эти вещества имеют следующие недостатки:

1) имеют слабую антикоагулянтную активность,

2) не проявляют антитромбоцитарного эффекта,

3) кратковременность действия в организме,

4) их нельзя использовать в клинике, так как при их распаде в кровотоке увеличится уровень свертывающих факторов – фибриногена, тромбина.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является расширение спектра действия средств на процессы свертывания крови.

Указанный технический результат достигается тем. что пептид формулы:

Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro

рекомендуют в качестве средства с антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной, фибринолитической и антитромботической активностями.

Пример 1. Синтез пептида Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro.

Гептапептид синтезировали ступенчатым наращиванием пептидной цепи классическими методами пептидной химии в растворе. При синтезе применяли метод смешанных ангидридов и метод активированных эфиров. Для синтеза использовали производные L-аминокислот. Упаривание растворов проводили на роторном испарителе при 40°С. Температуры плавления, определенные на столике для плавления Boetiys, даны без исправления. Индивидуальность полученных соединений проверяли с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем фирмы Silufol (Чехия). Вещества обнаруживали, опрыскивая пластинки раствором нингидрина и (или) о-толидина. Приведены хроматографические подвижности (Rf) в системах растворителей : ацетон : бензол : уксусная кислота (50:100:1) – (1); хлороформ : метанол (9:1) – (2); гексан: ацетон (3:2) – (3); бутанол : уксусная кислота: вода (4:1:1) – (4); бутанол: уксусная кислота : пиридин : вода (30:6:20:24) – (5); хлороформ : метанол : аммиак (6:4:1) – (6); бензол : этанол (8:2) – (7); этилацетат : ацетон : 50% уксусная кислота : вода (2:1:1) – (8); хлороформ : метанол (14:1) – (9): хлороформ : метанол : аммиак (8:1,75:0,25) – (10); хлороформ: метанол: аммиак (6,5:3,0:0,5) – (11).

Удельное вращение определяли на поляриметре “А1-ЕПО.

Элементный анализ на анализаторе “Carlo-Erba” модель 1106.

Проверку гомогенности пептида проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Все растворители абсолютировали соответствующим образом. Точки плавления не корректировали.

Принятые сокращения:

Arg – аргинин

Gly – глицин

Lys – лизин

Pro – пролин

Boc – трет-бутилоксикарбонил

Z – бензилоксикарбонильная группа (КБЗ)

OBzl – бензиловый эфир

OPfp – пентафторфениловый эфир

ДМФА – диметилформамид

ДЦГК – дициклогексилкарбодиимид

ДЦМ – дициклогексилмочевина

ТГФ – тетрагидрофуран

ТФУ – трифторуксусная кислота

ТФА – трифторацетат

ТЭА – триэтиламин

ЭА – этилацетат

ТСХ – тонкослойная хроматография

PivCl – пивалоил хлорид

I. Получение Boc-Pro-Gly-OH.

1. 10.75 г (50 ммоль) Вос-Pro растворяли в 150 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С, к раствору прибавляли 7,7 мл (50 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли 6,8 мл (55 ммоль) пивалоил хлорида (PivCl) перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С. охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор Gly.

Одновременно приготавливали раствор Gly.

2. Gly 4,5 г (60 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 35 мл воды и 60 мл ацетонитрила, прибавляли 8,4 мл (60 ммоль) триэтиламина, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали на роторном испарителе. К остатку добавляли ˜50 мл воды. Водный раствор подкисляли 3-кратным избытком NaHSO₄ (24,84 г)до рН 3, экстрагировали 5 раз по 100 мл этилацетатом. Объединенный раствор этилацетата промывали H₂О (50 мл). 10% раствором KHSO₄ (50 мл), Н₂О (50 мл), насыщенным раствором NaCl (50 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. К остатку добавляли сухой эфир. При добавлении эфира в колбе выпадает продукт, который отфильтровывали, промывая его на фильтре сухим эфиром. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, Р₂О₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход: 5,97 г (21,74 ммоль); (43,5%).

Т.пл. 70°С.

Rf – 0,863 (1); 0,903 (2); 0,746 (7); 0,847 (8).

II. Получение Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl.

1. 5.97 г (21,74 ммоль) Boc-Pro-Gly-OH растворяли в 100 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С, к раствору прибавляли избыток 1,1 (3,35 мл; 23,9 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли избыток 1,1 (2,34 мл; 23,9 ммоль) пивалоил хлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор HCl·Pro-OBzl.

Одновременно приготавливали раствор HCl·Pro-OBzl.

2. HCl·Pro-OBzl 6,3 г (26,1 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 50 мл ацетонитрила. прибавляли 4,0 мл (28,71 ммоль; избыток 1,1) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали. К упаренному остатку прибавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали H₂O (3 раза по 25 мл). 10% раствором KHSO₄ (3 раза по 25 мл), Н₂О (3 раза по 25 мл), 5% раствором NaHCO₃ (3 раза по 25 мл), Н₂О (3 раза по 25 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 25 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. К остатку добавляли ˜ 100 мл сухого эфира. При добавлении эфира в колбе выпадает продукт, который отфильтровывали, промывая его на фильтре сухим эфиром. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, P₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход: 8,12 г (17,66 ммоль); (81,23%).

Т.пл. 125-126°С.

Rf – 0,326 (1); 0,947 (2); 0,390 (3): 0,620 (7).

III. Получение ТФА-Pro-Gly-Pro-OBzl.

5,358 г (11.65 ммоль) Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 29,13 мл хлористого метилена, добавляли 29,13 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход – 4,63 г (9,7 ммоль) 98%,

Rf – 0,043 (1); 0,247(2); 0,018 (3),

IV. Получение Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

3.09 г Boc-Arg(NO₂)-OH 9,7 ммоль растворяли в 50 мл ТГФ и 10 мл ДМФА, добавляли 2,07 г (10,67 ммоль) ДЦГК, охлаждали до 0°С, перемешивали в течение 40 минут и добавляли раствор ТФА-Pro-Gly-Pro-OBzl в 50 мл ТГФ и 4,46 мл (9,7 ммоль) ТЭА. Перемешивали реакционную смесь в течение трех суток. Отфильтровывали осадок ДЦМ. упаривали раствор в вакууме, к остатку приливали 200 мл гексана, при этом отделялся целевой продукт в виде масла, которое растворяли в 500 мл этилацетата и промывали 3 раза по 25 мл 0,1 н. HCl. 3 раза по 25 мл Н₂O, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и упаривали. Остаток растворяли в ЭА и высаживали сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме над Р₂О₅/КОН и парафином, меняя несколько раз осушитель.

Выход – 4,76 г (7,9 ммоль) 85%.

Т.пл. 108-110°С.

Rf – 0,44 (4); 0,8 (5).

[]_D ²²=-77,8° (с=0,5; СН₃СООН).

V. Получение TFA·Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

4,76 г (7,9 ммоль) Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 20 мл хлористого метилена, добавляли 20 мл ТФУ. выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом. два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход количественный.

Rf – 0,16 (4); 0,27 (5).

VI. Получение Boc-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Boc-Pro 1.7 г (7,9 ммоль) растворяли в 20 мл ТГФ, добавляли 1,07 г (7,9 ммоль) ОБТ, охлаждали до 0°С и добавляли 1,8 г ДЦГК в 50 мл ТГФ. Через 40 мин к реакционной смеси добавляли раствор TFA·Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl (7,9 ммоль) в 50 мл ТГФ и 1,1 мл (7,9 ммоль) ТЭА. Перемешивали 2 часа при 0°С и 2-е суток при комнатной температуре, затем отфильтровывали ДЦМ, упаривали в вакууме, растворяли в 500 мл ЭА и обрабатывали аналогично Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Выход 4,07 г (6,5 ммоль) 67,8%.

Тпл. 147-148°С.

Rf – 0,42 (4); 0,72 (5); 0,31 (9).

VII. Получение TFA·Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Boc-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl 4,07 г (5,3 ммоль) растворяли в 14 мл хлористого метилена, добавляли 14 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂О₅/КОН и парафином.

Выход – 3,94 г (5,2 ммоль) 97%.

Rf – 0,246(2); 0,095 (4): 0,202(10).

VIII. Получение Boc-Lys(Z)-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

1. К Boc-Lys(Z)-OH 3,8 г (10 ммоль) в 25 мл абс. ЭА добавляли 2,26 г ДЦГК и 1,87 г пентафторфенола в 50 мл ТГФ, охлаждали до 0°С, Реакционную смесь перемешивали 2 часа при 0°С. отфильтровывали ДЦМ, раствор упаривали в вакууме, добавляли 25 мл абс. эфира и 75 мл гексана, постепенно при охлаждении отделялся осадок, который отфильтровывали и высушивали в вакууме.

Выход – 2,8 г (87%).

Т.пл. 117-120°С.

Rf – 0,84(4): 0,91 (9).

2. К TFA·Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl 2,27 г (5,2 ммоль), растворенного в 50 мл ТГФ и охлажденного до 0°С, прибавляли при перемешивании 0,75 мл ТЭА и затем в течение 2 часов четырьмя порциями Boc-Lys(Z)-OPfp 2,8 г (5,2 ммоль). Перемешивали 24 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали в вакууме, остаток растворяли в 300 мл ЭА и обрабатывали аналогично Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Выход – 3 г (3 ммоль) 58%.

Т.пл. 130-132°С.

Rf – 0,38(4); 0,75(5).

[]_D ²²=-86,2° (c=0,5 CH₃COOH).

IX. Boc-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OBzl.

3 г (3 ммоль) Boc-Lys(Z)-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 100 мл метанола, добавляли 0,5 мл 1н. соляной кислоты и 3 г катализатора – 10% окись палладия на нейтральной окиси алюминия, гидрировали в токе сухого водорода при комнатной температуре и давлении 1 атм в течение 6 часов. Затем катализатор отфильтровывали, промывали на фильтре метанолом. Объединенный фильтрат упаривали досуха. Остаток высаждали из абс. метанола сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали, сушили в вакууме.

Выход – 2,67 г (2.67 ммоль) 89%.

X. Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro.

2,67 г (2,67 ммоль) Boc-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OBzl суспензировали в 5 мл 2 н. соляной кислоты в диоксане и выдерживали при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем добавляли сухой эфир, выпавший осадок промывали декантацией сухим эфиром. Переосаждали из абсолютного метанола эфиром. Полученный осадок растворяли в 5 мл 30% этанола и наносили на колонку с Амберлистом А-21 (АсО^– – форма) для обмена хлористоводородной соли на ацетат. Элюировали пептид 100 мл 30% этанола, упаривали в вакууме досуха и высаждали из метанола абс. эфиром.

Выход – 1,54 г (2 ммоль) 75%.

Т.пл. – 151°С.

Rf – 0,24(6).

[]_D ²²=-65,0° (с=0,5 СН₃COOH).

Результаты ВЭЖХ: Колонка Zorbax ODS d=4,6 мм; t=35°C, скорость потока 1 мл/мин; A=50 мМ NH₄H₂PO₄ (pH 2,5); B=A+MeOH (1:1), 10-60% В (за 25 мин). Время выхода 16,5 мин.

Пример 2.

Берут 1 мг препарата формулы Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, растворяют в 2,5 мл физиологического раствора и вводят внутривенно в v.jugularis 5-ти лабораторным крысам по 0,5 мл (200 мкг) на 200 г массы тела. Контрольным животным тем же способом вводят 0,85% раствор NaCl в дозе 0,5 мл на 200 г массы тела. Через 10 мин берут кровь и центрифугируют ее при 2000 об/мин в течение 10 мин для получения бедной тромбоцитами плазмы.

В результате анализа параметров гемостаза обнаруживают следующее. В бедной тромбоцитами плазме обнаружено увеличение общей фибринолитической активности – в 1,2 раза, антикоагулянтной активности – в 1,2 раза, фибриндеполимеризационной активности – в 1,3 раз по сравнению с контролем (физиологическим раствором).

Пример 3.

Берут 1 мг препарата пептида формулы Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. растворяют в 2,5 мл физиологического раствора NaCl и вводят интраназально в течение 5 дней через каждые 24 часа 5-ти лабораторным крысам по 0,5 мл на 200 г массы тела. Контрольным животным тем же способом вводят 0,85% раствор NaCl. Через 5 дней после последнего введения берут кровь из v.jugularis и проводят ее центрифугирование при 2000 об/мин в течение 10 мин для получения плазмы, бедной тромбоцитами. Затем в изолированном зажимами участке v.jugularis (стаз) с помощью тромбина вызывают образование тромба и определяют через 1 час антитромботический эффект препарата.

В плазме обнаружено увеличение антикоагулянтной активности – в 1,3 раза, общей фибринолитической активности за счет увеличения активности активатора плазминогена – в 1,9 раза, фибриндеполимеризационной активности -130-160% в 1,5 раза по сравнению с контролем (физиологическим раствором). Препарат проявлял антитромботический эффект, превышающий антитромботические свойства плазмы крови здоровых крыс в 1,45 раза: если в контроле вес тромбов составлял 1,4 мг, то в опыте – 0,9 мг.

Таким образом, новый пептид Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro обладает широким спектром действия на процесс свертывания крови.

В таблице представлены данные, свидетельствующие о преимуществах заявленного пептида Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro по сравнению с эталонными препаратами комплекса гепарин-фибриноген и три- и тетра-пептидами (Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly).

Таким образом, из таблицы видно, что заявленный пептид Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro имеет преимущества перед препаратами комплекса фибриноген-гепарин и пептидами Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly по степени увеличения антикоагулянтной, фибринолитической и антитромбоцитарной активности в условиях in vitro; при внутривенном введении антикоагулянтная, фибриндеполимеризационная, фибринолитическая активности заявленного пептида превышают те же активности эталонного тетрапептида Gly-Pro-Gly-Gly; при интраназальном введении антитромботические эффекты пептида Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro превышают подобное действие тетрапептида Gly-Pro-Gly-Gly. Комплекс фибриноген-гепарин при интраназальном введении неактивен.

Формула изобретения

Пептид формулы: Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, обладающий антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной, антитромботической и фибринолитической активностями.