Патент на изобретение №2288274
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ИНГИБИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ САХАРОВ НА ПРОЦЕСС АДГЕЗИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для характеристики патогенности холерных вибрионов. Сущность изобретения заключается в том, что адгезию холерных вибрионов производят в присутствии ингибитора, в качестве которого используют углеводы, последние взаимодействуют с пектиновыми рецепторами холерных вибрионов и тормозят их адгезивные свойства. Для этого готовят 1% раствор углевода в 1 мл 1 млрд. взвеси холерных вибрионов, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 минут во влажной камере с последующим приготовлением микроскопических препаратов. Степень игибирующей способности сахаров на процесс адгезии исследуемой культуры холерных вибрионов определяют по шкале показателей ингибиции адгезии (ПИА): слабый показатель ингибиции в пределах 0,36-0,9, средний показатель 0,176-0,35 и высокий 0,01-0,175. Использование способа позволяет повысить биотехнологические возможности определения. 4 табл.
Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для характеристики патогенности холерных вибрионов. Адгезия бактериальных клеток к клеткам тканей макроорганизма остается малоизученной. Микробные клетки как нормальной, так и патогенной микрофлоры прикрепляются к поверхности слизистой оболочки посредством довольно сложных механизмов. Путь к пониманию этих механизмов лежит через одновременное изучение органелл адгезии у бактерий и поверхностных структур тканей макроорганизма, по отношению к которым адгезия осуществляется. Химическая природа холерных адгезинов, как и адгезинов других вибрионов, продолжает оставаться малоизученной. Есть немногочисленные сведения о том, что адгезины имеют белковую природу и обладают пектиновыми свойствами за счет углеводосвязывающего домена, что выражается в гемаглютинации. Известен способ определения адгезивной способности холерных вибрионов (см. А.С. СССР №1306107, кл. С 12 N 1/00, С 12 Q 1/02, Б 24, 1990), заключающийся в том, что исследуемую культуру инкубируют с 0,5-1%-ной взвесью эритроцитов кролика, используемых в качестве субстрата и взятых в равных объемах, в течение 25-40 минут, затем посредством приготовления микроскопических препаратов определяют адгезивную способность по количеству вибрионов, прикрепившихся к субстрату. Однако известный способ позволяет обнаруживать факт наличия адгезивной способности холерных вибрионов исследуемой культуры и не дает возможности определить наличие или отсутствие углеводосвязывающих доменов или пектиновых рецепторов, участвующих в процессе адгезии, а также оценить влияние разных веществ, а именно сахаров на процесс адгезии. За прототип выбран способ оценки адгезивных свойств энтеропатогенных бактерий на эритроцитах (см. В.И.Бриллис, статья “Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов”, журнал “Лабораторное дело”, №4, Москва, Медицина, 1986 г.). На предметном стекле смешивают 1 каплю 1 млрд. взвеси холерных вибрионов и 1 каплю 5-10% взвеси эритроцитов, приготовленных на 0,1 М растворе фосфата Na, инкубируют при 37°С в течение 30 минут во влажной камере, после этого мазки фиксируют спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимза, при этом изучение адгезии проводят под световым микроскопом с последующей оценкой среднего показателя адгезии (СПА), подсчет ведут на 100 эритроцитах, а адгезивность холерных вибрионов считают нулевой при СПА от 0 до 1; средней от 1,01 до 3; высокой – выше 3. Недостатком прототипа является то, что при наличии факта адгезии невозможно изучить специфичность рецепторов самих холерных вибрионов, участвующих в адгезии, природу мишеней для адгезии на поверхности эритроцитов, а также влияние различных веществ, в частности сахаров, на процесс адгезии. Эти обстоятельства снижают биотехнологические возможности прототипа и сужают его применение для диагностики и лечения холеры. Задача предлагаемого изобретения состояла в повышении биотехнологических возможностей способа в определении ингибирующей способности сахаров на адгезию холерных вибрионов. Поставленная задача достигается тем, что в известном способе определения ингибирующей способности сахаров на адгезию холерных вибрионов, включающем инкубирование исследуемой культуры с эритроцитами, адгезию холерных вибрионов проводят в присутствии ингибитора, в качестве которого используют углеводы, последние взаимодействуют с пектиновыми рецепторами холерных вибрионов и тормозят их адгезивные свойства, для осуществления этого готовят 1% раствор углевода в 1 мл 1 млрд. взвеси холерных вибрионов, которые инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 30-40 минут, затем на стекло наносят в равных объемах эритроциты кролика и взвесь вибрионов с углеводами, инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 минут во влажной камере с последующим приготовлением микроскопических препаратов и определяют по шкале степень ингибиции сахарами адгезии исследуемой культуры. При этом по шкале показателей ингибиции адгезии (ПИА) определяют: слабый показатель ингибиции в пределах 0,36-0,9, средний показатель 0,176-0,35 и высокий 0,01-0,175. Способ осуществляется следующим образом. В качестве ингибиторов используют 1% растворы разных углеводов, например глюкозу, маннозу, фруктозу, галактозу или углеводсодержащие препараты. Для проведения способа могут быть использованы эритроциты крови кролика, барана или человека. Первоначально готовят 1 млрд. взвеси холерных вибрионов исследуемой культуры. Потом сухую навеску углевода в количестве 10 мг/мл (1% раствор) соединяют со взвесью холерных вибрионов и инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 минут. Затем на предметное стекло наносят 1 каплю 5% эритроцитов (человека) и 1 каплю взвеси вибрионов с углеводами, инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 минут во влажной камере. После этого готовят мазок, фиксируют смесью Никифорова и окрашивают согласно методике В.И.Бриллиса. Учет производят посредством микроскопа в два этапа: 1 этап – считают средний показатель адгезии (СПА) по методике В.И.Бриллиса. Подсчет ведут на 100 эритроцитов. Например, если на 100 эритроцитах прикрепилось 200 вибрионов, то СПА=(200:100)=2. Из таблицы 1 видно, что этот показатель соответствует средней адгезивности. II этап – производят оценку среднего показателя ингибиции адгезии (ПИА) по шкале (см. таблицу 1). Предлагаемая шкала основывается на проведенных примерах с разными ингибиторами, в качестве которых были взяты разные углеводы и по их взаимодействию с пектиновыми рецепторами холерных вибрионов различных штаммов определена следующая зависимость. Расчет вели из учета среднего количества вибрионов, прикрепившихся к одному эритроциту при использовании углевода. Например, если на 100 эритроцитов прикрепилось 25 вибрионов, то ПИА=25:100=0,25. ПИА в пределах 0,36-0,9 – слабый показатель ингибиции, средний показатель 0,176-0,35 и высокий 0,01-0,175. В каждом опыте сравнивают два показателя СПА (без углевода) и ПИА (реакция с углеводами). Если, например, СПА=2, а ПИА=0,25, то делаем вывод, что углевод эффективно ингибировал адгезию (в пределах среднего показателя). Таким образом, имеет место средний и высокий показатель ингибиции адгезии по сравнению с контролем адгезии по методике В.И.Бриллиса. Делаем вывод о наличии и специфичности пектиновых рецепторов, участвующих в адгезии, а также о влиянии определенного сахара на этот процесс. Пример 1 Определяют ингибирующую способность углевода на адгезию холерных вибрионов у штамма V. Cholerae cholerae 569 В. В качестве ингибитора берут галактозу в формах Д и Из таблицы 2 видно, что штамм высокоадгезивен, СПА=5. Галактоза в формах Д и Р снижает адгезию до 1,7 (ПИА), однако, согласно таблице 1 при СПА=1,01-2,9 штаммы считаются среднеадгезивными. Таким образом, делаем вывод, что галактозоспецифический рецептор (пектин) не доминирует при адгезии в отличие от глюкозоспецифического пектина, который активно участвует в адгезии, так как глюкоза подавляет адгезию до ПИА=0,1, что согласно таблице 1 соответствует среднему показателю ингибиции адгезии. Пример 2 В качестве исследуемых культур используют штаммы V. Cholerae O 139 (“Бенгал”), а в качестве ингибиторов Последовательность действий способа такая как и в примере 1, а их результаты сведены в таблице 3. Анализируя показатели таблицы 3, приходим к выводу, что штаммы “Бенгал” обладают средней адгезивностью, учитывая СПА, согласно таблице 1, галактозоспецифичный рецептор имеет место и активно участвует в адгезии, так как ПИА укладывается в диапазон высокого показателя ингибиции адгезии (0,01-0,175), слабее выражен глюкозоспецифичный пектиновый рецептор – ПИА соответствует среднему показателю ингибиции адгезии (0,176-0,35) и вообще отсутствует пектин, узнающий N-ацетилманнозамин, так как во всех шести штаммах ПИА более 1. Пример 3 Отличается от примера 1 и 2 тем, что в качестве исследуемых культур используют штаммы V. Cholerae cholerae 569 В, V. Cholerae Eltor 1310, 5879, 18210, 3119, V. Cholerae О 139 16064, 16065, 16131, 16063, 16077. В качестве ингибитора адгезии используют глюкосалан – препарат для регидрационной терапии, содержащий глюкозу. Результаты примера сведены в таблице 4. Таким образом, по результатам исследования установлено, что глюкосалан эффективно ингибирует адгезию холерных вибрионов различных штаммов. Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет углеводсодержащих ингибиторов обнаруживать специфичность углеводосвязующего домена в холерных вибрионах исследуемой культуры к сахарам, что способствует уменьшению их адгезивной способности благодаря связыванию отдельных пектиновых рецепторов холерных вибрионов со специфическим для него углеводом. При этом по шкале показателей ингибиции адгезии (ПИА), разработанной специалистами Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института, возможно быстро установить степень ингибиции сахарами исследуемой культуры, что расширяет диагностические возможности в биотехнологии и может быть использовано в практическом применении при лечении холеры и ее профилактики при эпидемических вспышках, так как адгезия является начальным этапом патогенеза этого инфекционного заболевания.
Формула изобретения
Способ определения степени ингибирующей способности сахаров на процесс адгезии холерных вибрионов, включающий инкубацию исследуемой культуры совместно с эритроцитами, отличающийся тем, что адгезию холерных вибрионов производят в присутствии ингибитора, в качестве которого используют углеводы, последние взаимодействуют с пектиновыми рецепторами холерных вибрионов и тормозят их адгезивные свойства, для этого готовят 1%-ный раствор углевода в 1 мл 1 млрд. взвеси холерных вибрионов, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 мин во влажной камере с последующим приготовлением микроскопических препаратов, в которых определяют степень ингибиции адгезии по шкале показателей ингибиции адгезии (ПИА), при этом за слабую степень ингибиции адгезии принимают ПИА в пределах 0,36-0,9, среднюю степень – в пределах 0,176-0,35 и высокую – 0,01-0,175.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
и глюкозу. Готовят 1% раствор галактозы и глюкозы в 1 мл 1 млрд. взвеси холерных вибрионов и инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 минут. Затем на предметное стекло наносят 1 каплю 5% эритроцитов барана и 1 каплю взвеси вибрионов с галактозой и глюкозой. Инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 минут во влажной камере, готовят мазок, фиксируют смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимза. По истечении времени инкубации, под световым микроскопом считают показатель ингибиции адгезии – среднее количество вибрионов, прикрепившихся к одному эритроциту при использовании галактозы в формах Д и