Патент на изобретение №2288008

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕКРЕТОРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ЖИВОТНЫХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для получения секреторного иммуноглобулина A (S-IgA), используемого для оценки иммунного статуса животного. Способ заключается в биохимической обработке биологической жидкости животных, отделении целевого продукта гель-фильтрацией с последующим замораживанием, при этом биологическую жидкость центрифугируют при 1000-1700 g в течение 15-30 минут, подвергают диализу против 0,02 М Трис-HCl рН 8,0-8,2 в течение 1,5-2,5 часов и гель-фильтрации на Sephacryl S-400 с 0,015-0,02 М Трис-HCl буфером с рН 8,0-8,2 и с 0,4-0,9 М хлористым натрием, отделяя вторую фракцию белков под контролем иммуноэлектрофореза с использованием антисывороток к белкам животных, а целевой продукт получают концентрированием фракций белков в полиэтиленгликоле-40000 до содержания иммуноглобулина А в целевом продукте в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных в 3-6 раз. Способ обеспечивает повышение выхода и качества целевого продукта, а также ускорение способа.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для получения секреторного иммуноглобулина A (S-IgA), используемого для оценки иммунного статуса животного.

Известен способ получения IgA из биологической жидкости животных путем биохимической обработки биологической жидкости, отделением целевого продукта гель-фильтрацией в сочетании с ионообменной хроматографией (Труды ВИЭВ, 2003, том 73, стр.197-200). Согласно известному способу проводят 3-кратное высаливание сульфатом аммония и обработку сульфатом цинка для получения гамма-глобулиновой фракции, которую подвергают гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Гель-фильтрацию проводят на Sephacryl S-300 в 0,05 М Трис-HCl буфере рН 8,0. Анализ фракций на содержание IgA проводят методом иммуноэлектрофореза с использованием антисывороток ко всем белкам крупного рогатого скота и овец. Фракции второго и восходящей части третьего пиков, содержащие IgA, объединяют, концентрируют и подвергают ионообменной хроматографии в градиенте рН и ионной силы (от 0,01 М рН 7,4 до 0,13 М рН 6,0 фосфатного буфера). IgA был получен в элюате 3 пика при пропускании 0,06 М фосфатного буфера рН 6,5. Фракции, содержащие IgA, концентрируют и исследуют на содержание белка и иммунохимическую чистоту методом иммуноэлектрофореза и электрофореза в ПААГ-ДСН.

Недостатками известного способа являются низкий выход и качество целевого продукта, длительность и сложность получения иммуноглобулина А из биологической жидкости животных.

Задачей заявленного технического решения является повышение выхода и качества целевого продукта, а также ускорение способа.

Поставленная задача решается в способе получения иммуноглобулина А из биологической жидкости животных, отделением целевого продукта гель-фильтрацией с последующим замораживанием тем, что биологическую жидкость центрифугируют при 1000-1700 g в течение 15-30 мин, подвергают диализу против 0,02 М Трис-HCl буфера с рН 8,0-8,2 в течение 1,5-2,5 часов и гель-фильтрации на Sephacryl S-400 с 0,015-0,02 М Трис-HCl буфером с рН 8,0-8,2 и с 0,4-0,9 М хлористым натрием, отделяя вторую фракцию белков под контролем иммуноэлектрофореза с использованием антисывороток к белкам животных, а целевой продукт получают концентрированном фракций белков в полиэтиленгликоле-40000 до содержания иммуноглобулина А в целевом продукте в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных в 3-6 раз.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы получения S-IgA аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».

Все режимы способа осуществимы в лабораторных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Впервые предложен способ получения S-IgA, в котором биологическую жидкость животных без предварительной очистки от балласта последовательным осаждением сульфатом аммония, центрифугируют, диализуют и отделяют целевой продукт из исследуемой биологической жидкости гель-фильтрацией на Sephacryl S-400 (добавление к Трис-HCl буферу хлористого натрия только в определенных концентрациях позволяет получить неочевидный положительный эффект – повышение выхода и качества целевого продукта). Кроме того, исключение ряда этапов в способе получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости животных при увеличении выхода и качества целевого продукта позволило существенно упростить и ускорить процесс его получения, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень». Способ иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. Получение S-IgA из носовых секретов крупного рогатого скота. 5,5 мл носового секрета центрифугируют при 1700 g в течение 15 мин и диализуют против 0,02 М Трис-HCl буфера с рН 8,0 в течение 1,5 часов. Затем диализат в объеме 5 мл подвергают фракционированию на Sephacryl S-400 на колонке размером 12×400 мм. В качестве элюента используют 0.015М Трис-HCl буфер рН 8,0 с 0,4 М NaCl. Оптическую плотность фракций, выходящих из колонки и собираемых в объеме 6 мл, определяют на спектрофотометре при 280 нм. Белок, элюированный из колонки во 2-й фракции, содержал иммунохимически чистые иммуноглобулины класса А (одна линия преципитации, соответствующая S-IgA), что подтверждалось иммуноэлектрофоретическим анализом белковых фракций.

Концентрируют в ПЭГ (40.000) до содержания IgA 10,5 мг/мл, что в 4 раза больше в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных. Целевой продукт замораживают при -20°С. Время получения S-IgA составляет 24 часа. В то же время известным способом время получения S-IgA из носовых секретов составляет 3 суток (в 3 раза медленнее, чем заявляемый способ), а количество полученного IgA составляет 3,5 мг/мл (т.е. на 67% меньше).

Пример 2. Получение S-IgA из слюнной жидкости телят. На первом этапе 7 мл слюнной жидкости телят центрифугируют при 1350 g в течение 30 мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость диализуют против 0,02 М Трис-HCl буфера с рН 8,1 в течение 2,0 часов. Затем диализат в объеме 6 мл подвергают фракционированию на Sephacryl S-400 на колонке размером 12×400 мм. В качестве элюента используют 0,02 М Трис-HCL буфер рН 8,2 с 0,9 М NaCl. Оптическую плотность фракций, выходящих из колонки и собираемых в объеме 5 мл, определяют на спектрофотометре при 280 нм. Белок, элюированный из колонки во 2-й фракции, содержал иммунохимически чистые иммуноглобулины класса А (одна линия преципитации, соответствующая S-IgA), что подтверждалось иммуноэлектро-форетическим анализом белковых фракций.

Концентрируют в ПЭГ (40.000) до содержания S-IgA 2,0 мг/мл, что в 6 раз больше в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных, и замораживают при -20°С. В то же время известным способом время получения S-IgA из слюны телят составляет 3 суток (в 3 раза медленнее, чем заявляемый способ), а количество полученного IgA составляет 0,5 мг/мл (т.е. на 75,0% меньше).

Пример 3. Получение S-IgA из слезных секретов телят.6 мл слезной жидкости центрифугируют при 1000 g в течение 22,5 мин, надосадочную жидкость диализуют против 0,02 М Трис-HCL буфера с рН 8,2 в течение 2,5 часов. Затем диализат в объеме 5,5 мл подвергают фракционированию на Sephacryl S-400 на колонке размером 12×400 мм. В качестве элюента используют 0,0175 М Трис-HCl буфер рН 8,1 с 0,65 М NaCl. Оптическую плотность фракций, выходящих из колонки и собираемых в объеме 5 мл, определяют на спектрофотометре при 280 нм. Белок, элюированный из колонки во 2-ой фракции, содержал иммунохимически чистые иммуноглобулины класса А (одна линия преципитации, соответствующая S-IgA), что подтверждалось иммуноэлектрофоретическим анализом белковых фракций. Концентрируют в ПЭГ (40.000) до содержания S-IgA 7,5 мг/мл, что в 3 раза больше в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных, и замораживают при -20°С. В то же время известным способом время получения S-IgA из слезных секретов составляет 3 суток (в 3 раз медленнее, чем заявляемый способ), а количество полученного S-IgA составляет 3,5 мг (т.е. на 54,0% меньше).

Как показали результаты экспериментальных исследований, согласно примерам 1-3, предлагаемый способ позволяет на 54,0%-75,0% повысить выход целевого продукта с сохранением его биологической активности, а также ускорить в 3 раза процесс получения S-IgA.

Формула изобретения

Способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости животных путем биохимической обработки биологической жидкости, отделения целевого продукта гель-фильтрацией с последующим замораживанием, отличающийся тем, что биологическую жидкость центрифугируют при 1000-1700 g в течение 15-30 мин, подвергают диализу против 0,02 М Трис-HCL рН 8,0-8,2 в течение 1,5-2,5 ч и гель-фильтрации на Sephacryl S-400 с 0,015-0,02 М Трис-HCL буфером с рН 8,0-8,2 и с 0,4-0,9 М хлористым натрием, отделяя вторую фракцию белков под контролем иммуноэлектрофореза с использованием антисывороток к белкам животных, а целевой продукт получают концентрированием фракций белков в полиэтиленгликоле-40000 до содержания иммуноглобулина А в целевом продукте в сравнении с содержанием его в исходной биологической жидкости животных в 3-6 раз.