Патент на изобретение №2287826

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНТЕРФЕРОНОТЕРАПИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ B

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии. Сущность способа прогнозирования эффективности интерферонотерапии больных хроническим гепатитом В: определяют содержание ФНО- в сыворотке крови и синтез ИФН- мононуклеарными клетками in vitro до и через 4,5 ч после первого введения препарата интерферона- больному ХВГ В. При выявлении содержания ФНО- в сыворотке крови до введения, не превышающем 59,31 пг/мл, и повышении после первого введения интерферона- уровня ФНО- более чем на 46,1% и синтеза ИФН- более 70,25% от исходных прогнозируют хорошую эффективность интерферонотерапии в ходе 6-месячной интерферонотерапии. При содержании ФНО- в сыворотке крови выше 74,51 пг/мл и повышении показателей ФНО- не более 24,9%, а ИФН- не более 70% или их снижении после первой инъекции интерферона- прогнозируют отсутствие вирусологического ответа, а значит недостаточную эффективность интерферонотерапии. Использование способа позволяет уже после первого введения препарата интерферона- прогнозировать результаты интерферонотерапии при хроническом вирусном гепатите В. 1 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”печени у детей с хроническим вирусным гепатитом В, С и В + С при лечении интерфероном-. Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2002, №2, с.69-72. CAGLAR M. et al. Prediction of therapy response to interferon-alpha in chronic viral hepatitis-B by liver and hepatobiliary scintigraphy. Ann. Nucl. Med. 2002 Nov; 16 (7): 511-4, (реферат), [он-лайн] [03.04.2006], найдено из БД PubMed.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии.

Создание надежных прогностических критериев эффективности лечения хронического вирусного гепатита (ХВГ) в силу высокой стоимости противовирусных препаратов, в частности интерферонов, представляет важную практическую задачу. Кроме того, интерферонотерапия ХГ В даже с использованием схем активной терапии дает не более 40-50% случаев вирусологического ответа, характеризуясь большим количеством побочных эффектов [1].

Ретроспективный метаанализ показал, что вероятность ответа ХВГ В на интерферонотерапию коррелирует с некоторыми клиническими, биохимическими и серологическими особенностями. К благоприятным прогностическим критериям положительного ответа на интерферонотерапию относят: 1) низкий уровень HBV-ДНК в сыворотке; 2) высокий уровень сывороточных аминотрансфераз; 3) активный процесс, выявляемый при гистологическом исследовании печени и ограниченный фиброз; 4) короткая продолжительность болезни; 5) отсутствие других заболеваний и осложнений типа почечной недостаточности, HIV-инфекции, HDV-инфекции или иммуносупрессии [2-10].

В качестве признаков, благоприятствующих успешному лечению, рассматриваются: молодой возраст больных, инфицирование HBV в зрелом возрасте, инфицирование “диким” штаммом вируса (НВе-положительные случаи), нормальный уровень -глутамилтранспептидазы, гетеросексуальная ориентация пациента, парентеральное заражение вирусом, отсутствие биохимических признаков холестаза, слабовыраженный аутоиммунный компонент воспаления, женский пол пациентов, доза вводимого интерферона не менее 5 ME 3 раза в неделю на срок не менее 4 месяцев. Цитолитический криз, развивающийся у больного в первые 12 недель лечения интерфероном, также является предвестником хорошего ответа на лечение [11-18].

Успех лечения считается сомнительным в ряде случаев с набором признаков, противоположных указанным, а также при наличии у больных вирусной ДНК и ДНК-полимеразы без HBeAg и при концентрации HBV-ДНК выше 200 пг/мл. Терапия интерфероном- из-за низкой эффективности и большого количества побочных эффектов не рекомендуется пациентам с нормальным уровнем сывороточных аминотрансфераз, с терминальной стадией болезни печени или с тяжелой сопутствующей патологией (недостаточность функции почек, тяжелая иммунная недостаточности. Однако, как справедливо указывается, ни один из этих факторов, ни их комбинация не прогнозируют ремиссии у конкретного больного [6, 16, 19].

Как видно, большинство представленных критериев относятся к числу факторов ответа, принадлежащих больному, и характеризуются в основном качественными (есть-нет) показателями.

Недостатки этого и других перечисленных выше методов прогнозирования очевидны:

– высокая стоимость и сложность метода определения концентрации HBV-ДНК;

– отсутствие для большинства критериев признаков, учитывающих одновременно характеристики и больного, и вируса;

– способность показателя вирусной нагрузки к спонтанным колебаниям в течение суток, при разном уровне физической активности, инсоляции, употреблении алкоголя;

– недоучет вида HBV у больного (“дикий” или НВе-негативный мутант), имеющего различные прогностические характеристики.

Некоторые из прогностических методик эффективности интерферонотерапии больных ХВГ В также имеют недостатки. Это сложность оценки сроков и путей инфицирования, сложность оценки степени фиброза печени (необходимость выполнения инвазивной методики – биопсии печени), отсроченность оценки такого прогностического показателя как цитолитический криз.

Поставлена задача разработки доступного для практических учреждений здравоохранения способа прогнозирования эффективности интерферонотерапии при хроническом вирусном гепатите В, позволяющего судить о вероятных результатах лечения уже после первого введения препарата интерферона-.

Сущность способа заключается в том, что в сыворотке и в мононуклеарных клетках периферической крови, взятых до и после первого введения больному препарата интерферона- в лечебной дозе, определяют соответственно содержание фактора некроза опухоли- (ФНО-) и синтез in vitro интерферона- (ИФН-) – секретируемые клетками белковые медиаторы межклеточных взаимодействий, отражающие тяжесть иммунного воспаления в печени.

Способ осуществляется следующим образом.

Критерием включения является наличие доказанного ХГ В (вирусные маркеры, в том числе HBV-ДНК, гистология печеночного биоптата).

Критерии исключения – сопутствующая патология (острые или хронические заболевания в стадии обострения), коинфекция вирусами D и С, HIV, употребление алкоголя и прием лекарственных препаратов в течение 2 недель до проведения исследования.

Забор венозной крови у больных проводят в утренние часы, натощак и через 4,5 часа после первого введения препарата интерферона – на “пике” его терапевтической активности. Сыворотку крови отделяют центрифугированием. Мононуклеарные клетки выделяют на градиенте плотности фиколл-верографин по методу Ferrante А. & Thoung Y.H. [20], полученную популяцию стандартизируют (2×10⁶ клеток в 1 мл) и инкубируют 24 часа в питательной среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, 2% фетальной телячьей сыворотки и гентамицина во влажной, обогащенной СО₂ атмосфере, при 37°С. Содержание ИФН- в супернатантах после центрифугирования и ФНО- в сыворотке крови определяют методом ИФА с помощью тест-наборов “Цитокин” (Россия). Спонтанная продукция ИФН- МНК у здоровых составляет 34,82±4,03 пг/2×10⁶ клеток (колебания от 22,09 до 46,85), содержание ФНО- в сыворотке крови – 22,41±3,67 пг/мл (колебания от 10,82 до 34,0).

При содержании ФНО- в сыворотке крови, не превышающем 59,31 пг/мл, и хорошей реакции показателя ФНО- и синтеза ИФН- клетками в ответ на первое введение интерферона- (повышении ФНО- более 46,1% и ИФН- более 70,25% от исходных уровней) можно прогнозировать вирусологический ответ (респондерство). При содержании ФНО- в сыворотке крови выше 74,51 пг/мл и в случае ограниченной либо негативной реакции цитокинов на первую инъекцию интерферона- (повышении ФНО- не более 24,9%, ИФН- не более 70% или снижении обоих показателей) следует ожидать отсутствие вирусологического ответа (нон-респондерство).

При разработке способа обследовали больных с ХВГ В. После проведенного обследования назначают терапию препаратами интерферона (интроном А – “Shering Plough” или реафероном – “Вектор”) в дозе 5-6 млн ME 3 раза в неделю. Лечение проводят в течение 24 недель. После завершения терапии анализировали ее результаты по клинико-биохимическим и вирусологическим показателям, включая тестирование HBV-ДНК. Больных разделили на 2 группы – “ответчиков” (респондеров) с исчезновением ДНК вируса, сероконверсией, нормализацией активности АлАТ и “неответчиков” (нон-респондеров) с сохранением HBV-ДНК, отсутствием сероконверсии и нормализацией или снижением исходно повышенной активности АлАТ в анализируемый срок. Проводили ретроспективный анализ в обеих группах, оценивая исходные показатели спонтанного синтеза ИФН- МНК, содержание ФНО- в сыворотке крови и динамику обоих цитокинов в ходе первого введения препарата интерферона-, которые сопоставляли с результатами 6-месячного лечения больных ХВГ В препаратами интерферона-.

Результаты

В группе 11 пациентов с наличием вирусологического ответа на 6-месячную интерферонотерапию (респондеров), включая сероконверсию HBeAg в анти-НВе, синтез ИФН- мононуклеарами составил 19,06±3,04 пг/2×10⁶ кл. (колебания от 12,26 до 25,86) с достоверным (Р<0,05) увеличением после введения первой дозы интерферона до 32,45±4,11 пг/2×10⁶ кл. Средний уровень увеличения синтеза составил 70,25%. Содержание ФНО- в этой группе было 50,1±4,12 пг/мл (колебания от 40,89 до 59,31) до введения первой дозы препарата интерферона и 98,7±5,4 пг/мл (колебания от 86,63 до 110,77) после введения (Р<0,05). Средний уровень увеличения содержания ФНО- составил 96% с колебаниями крайних значений от 46,1% до 171%. В этой группе было 7 больных, инфицированных вирусом-мутантом (НВУ-ДНК+, HBeAg-) и 4 инфицированных “диким” типом вируса (HBV-ДНК+, HBeAg+).

Во второй группе из 8 больных с тем же соотношением инфицированности по типам вируса, но без вирусологического ответа на 6-месячную интерферонотерапию (сохранение HBV-ДНК, отсутствие сероконверсии) синтез ИФН- МНК (14,99±0,95 пг/2×10⁶ кл., колебания от 12,87 до 17,11) возрастал после первой инъекции препарата интерферона- незначительно – до 20,13±5,34 пг/2×10⁶ кл. (колебания от 8,19 до 32,07) – в среднем на 34,3%. При этом колебания крайних значений (в процентах от уровня до введения) определялись от снижения показателя после введения препарата до увеличения, но не превышающего 70%. Содержание ФНО- в сыворотке крови нон-респондеров (85,4±4,87 пг/мл) с колебаниями от 74,51 до 96,29 пг/мл было достоверно более высоким, чем у респондеров. После первой дозы препарата интерферона- определялось отсутствие какой-либо динамики показателя ФНО- – 84,2±3,96 пг/мл (колебания от 75,39 до 93,05). Сопоставление крайних значений ФНО- после и до введения продемонстрировало снижение показателя или его возрастание, не превышающее 24,9% (табл.).

Таким образом, вирусологический ответ на монотерапию интерфероном- больных хроническим вирусным гепатитом В (при инфицировании как “диким” типом вируса, так и вирусом-мутантом) следует ожидать в случае, если до начала лечения содержание ФНО- в сыворотке крови больных не превышает 59,31 пг/мл, но возрастает после введения первой дозы интерферона- на 46,1% и более от уровня до введения, а синтез ИФН- МНК после первого введения препарата интерферона- увеличивается более чем на 70,25% от показателя синтеза цитокина до введения.

Отрицательный (только биохимический) ответ на монотерапию интерфероном- больных хроническим гепатитом В – с сохранением после 6 месяцев лечения ДНК-HBV, HBsAg и/или HBeAg (нон-респондерство) может быть прогнозирован при уровне сывороточного ФНО-, превышающем 74,51 пг/мл, снижении его количества после первого введения препарата интерферона- или увеличении, но не превышающем 24,9% от уровня до введения, а также при снижении синтеза ИФН- мононуклеарами после инъекции первой дозы препарата или его увеличении, но не выше 70% от уровня до введения интерферона-.

Таблица
Показатели ИФН- и ФНО- у больных ХВГ В в зависимости от результатов 6-месячной интерферонотерапии
Изучаемый показатель	Группы обследованных
	респондеры	нон-респондеры
Спонтанный синтез ИФН- МНК до первого введения интерферона (пг/2×106 кл.)	19,06±3,04 (12,26-25,86)	14,99±0,95 (12,87-17,11)
Спонтанный синтез ИФН- МНК после первого введения интерферона (пг/2×106 кл.)	32,45±4,11* (23,26-41,64)	20,13±5,34 (8,19-32,07)
Содержание ФНО- в сыворотке крови до первого введения интерферона (пг/мл)	50,1±4,12 (40,89-59,31)	85,4±4,87** (74,51-96,29)
Содержание ФНО- в сыворотке крови после первого введения интерферона (пг/мл)	98,7±5,4* (86,63-110,77)	84,2±3,96 (75,39-93,05)
Примечание: * – Р<0,05 до и после первого введения препарата интерферона-; ** – Р<0,05 в сравниваемых группах респондеров и нон-респондеров.

Клинические примеры

Пример 1. Больной А., 42 лет. История болезни №1688. Находился в гастроэнтерологическом отделении краевой больницы со 2 по 20 апреля 1998 года.

Диагноз. Хронический вирусный гепатит В, репликативная фаза HBV-инфекции, умеренно выраженная активность.

Жалобы на периодические боли в правом подреберье, вздутие живота, горечь во рту, повышенную утомляемость.

Анамнез. Страдал инъекционной наркоманией, пользуясь одним шприцем с партнером, который был носителем HBsAg. Последние 10 лет наркотики не употребляет.

Объективно. Состояние удовлетворительное. Кожа и слизистые обычной окраски. На груди единичные телеангиэктазии, тоны сердца ритмичные, слегка приглушенные. ЧСС и АД в пределах нормы. В легких дыхание везикулярное. Живот мягкий, слегка болезненный в правом подреберье. Размеры печени по Курлову: 15×10×8 см. По консистенции печень плотная, поверхность ее гладкая. Селезенка не пальпируется.

Общие анализы крови и мочи в пределах нормы. Билирубин 13,67 мкмоль/л. АлАТ 174 ед./л, АсАТ 114 ед./л, ГГТ 27 ед./л, ЩФ 100 ед./л. Протромбиновый индекс 90%. Общий белок 79 г/л, альбумины 56%, глобулины: – 16%, – 10%, – 18%. Глюкоза крови 5,5 ммоль/л. Тимоловая проба 9,8 ед. Сывороточное железо 30,5 мкмоль/л.

Вирусные маркеры: HBsAg (+), anti-HBs (-), anti-HBc суммарные (+), HBeAg (-), anti-HBe (+), HBV-ДНК (+), anti-HCV (-).

УЗИ. Печень: правая доля 162 мм, левая – 100 мм, эхогенность повышена. Внутрипеченочные протоки не расширены. Воротная вена 11 мм, селезеночная – 7 мм. Холедох 7 мм. Желчный пузырь 68×26 мм, стенки уплотнены, утолщены, без конкрементов. Поджелудочная железа: головка 30 мм, тело 18 мм, хвост 20 мм, ткань несколько неоднородна, эхогенность умеренно повышена. Селезенка 127×48 мм, ткань однородная.

Биопсия печени. Дольковое строение сохранено. Портальные тракты неравномерно расширены с диффузной инфильтрацией лимфоцитами, макрофагами, фибробластами. Инфильтрация местами проникает через пограничную пластинку, достигая 3 зоны дольки. Отмечается неравномерно выраженная пролиферация желчных протоков. Лобулярный компонент выражен на территории 2-3 гепатоцитов. Фиброз стенок центральных вен и мелкие очаги склероза в дольке. Гепатоциты в состоянии гидропической, очаговой балонной и крупнокапельной жировой дистрофии, отдельные гепатоциты двуядерные, содержат эозинофильные включения. Заключение: хронический гепатит умеренной активности. Индекс Кноделя 9 баллов, индекс Десмета 2 балла.

Спонтанный синтез ИФН- мононуклеарами до первого введения интрона А в дозе 3 млн ME внутримышечно составил 16,81 пг/2×10⁶ кл., после первого введения – 17,20 пг/2×10⁶ кл. Содержание ФНО- в сыворотке крови до первой инъекции препарата интерферона составило 91 пг/мл, после введения – 82,2 пг/мл.

Больному начато лечение интроном А по 5 млн ME 3 раза в неделю. Лечение переносил тяжело – отмечались боли всуставах ног, слабость в ногах, снижение потенции, депрессия. Через 6 месяцев отмечалась нормализация активности аминотрансфераз, однако сохранялись HBsAg и HBV-ДНК в сыворотке крови.

Таким образом, у больного А. с отсутствием через 6 месяцев интерферонотерапии вирусологического ответа определялся исходный уровень ФНО- в крови 91 пг/мл, т.е. превышающий 74,51 пг/мл, снижение его после первого введения интрона А до 82,2 пг/мл и повышение спонтанного синтеза ИФН- после первой инъекции препарата интерферона с 16,81 до 17,20 пг/2×10⁶ кл. – менее, чем на 70%, что в целом соответствовало предложенным критериям нон-респондерства.

Пример 2. Больной Б., 37 лет. История болезни №6037. Находился в гастроэнтерологическом отделении с 24 ноября по 22 декабря 1999 года.

Клинический диагноз: хронический вирусный гепатит В, репликативная фаза инфекции, высокая степень активности. Жалобы на значительную утомляемость, периодические тупые боли и постоянную тяжесть в правом подреберье.

Из анамнеза. В 1982 году перенес острый вирусный гепатит. В 1998 году призывался в Чечню, где пробыл в сложных условиях около 6 месяцев. После возвращения начал отмечать повышенную утомляемость, иктеричность склер. За медицинской помощью обратился только в ноябре 1999 года.

Объективно. Состояние удовлетворительное. Кожные покровы и склеры слегка желтушны. Сердце, легкие – без патологии. Живот мягкий, умеренно болезненный в правом подреберье. Печень выступает из-под края реберной дуги на 2 см, умеренно плотная с гладкой поверхностью. Размеры по Курлову 14×10×8 см. Пальпируется нижний полюс селезенки.

Общие анализы крови, мочи без отклонений от нормы. Билирубин 63,2 (прямой – 8,85) мкмоль/л. АлАТ 608 ед./л, АсАТ 255 ед./л. Общий белок 82 г/л, альбумины 50%, глобулины: – 20%, – 8%, – 22%. ГГТ 110 ед./л, ЩФ 318 ед./л, ЛДГ-539 ед./л. Протромбиновый индекс 96%.

Вирусные маркеры: HBsAg (+), anti-HBs (-), HBeAg (-), anti-HBe (+), anti-HBc IgM (+), HBV-ДНК (+), anti-HCV (-), anti-HDV (-).

УЗИ. Печень: правая доля 161 мм, левая – 104 мм, эхогенность повышена, ткань диффузно неоднородна. Внутрипеченочные протоки не расширены. Воротная вена 13 мм, селезеночная – 9 мм. Холедох 5 мм. Желчный пузырь 56×21 мм, стенки уплотнены, содержимое гомогенное. Поджелудочная железа: головка 26 мм, тело 15 мм, хвост 17 мм, ткань однородна, гиперэхогенна. Селезенка 138×64 мм, ткань однородная. Селезеночная вена в воротах 10 мм.

Биопсия печени. В портальных трактах и перицентральных областях отмечается обильная инфильтрация плазматическими клетками, лимфоцитами, гистиоцитами, фибробластами. Имеются ступенчатые и мостовидные некрозы. Выражен лобулярный компонент. Встречаются матовостекловидные гепатоциты. Портальные тракты расширены, имеются признаки портального фиброза. Заключение: хронический гепатит с высокой степенью активности. ИГА 14 баллов. Индекс Десмета 1 балл.

Содержание ФНО- в сыворотке крови до введения первой дозы реаферона (3 млн ME, внутримышечно) составило 59,12 пг/мл, после введения – 96,8 пг/мл. Спонтанный синтез ИФН- мононуклеарными клетками до первой инъекции реаферона составил 12,38 пг/2×10⁶ кл., после инъекции – 26,63 пг/2×10⁶ клеток.

Было начато лечение реафероном в дозе 6 млн ME 3 раза в неделю. На первое введение (3 млн ME) отмечался озноб, артралгия, подъем температуры до 39°С. К моменту выписки из отделения переносимость препарата хорошая. При контрольном осмотре через 3 месяца самочувствие удовлетворительное, сохраняется двукратное повышение активности АлАТ. Через 6 месяцев от начала лечения: аминотрансферазы в пределах нормы, HBsAg (-), anti-HBs (+), HBeAg (-), anti-HBe (+), anti-HBc IgM (-), anti-HBc суммарные (+), HBV-ДНК (-). Таким образом, у больного ХВГ В с выраженной активностью процесса удалось добиться сероконверсии, исчезновения виремии и нормализации активности цитолитических ферментов.

Приведенный клинический пример демонстрирует, что у больного Б. с формированием после 6-месячной интерферонотерапии вирусологической ремиссии ХВГ В исходное содержание ФНО- в сыворотке крови было 59,12 пг/мл, т.е. менее 59,31 пг/мл и возросло после первого введения препарата интерферона с 59,12 до 96,8 пг/мл – на 63,7% (т.е. более 46,1%). Спонтанный синтез ИФН- МНК до начала лечения в динамике первого введения препарата интерферона увеличился более чем на 70,25% – на 115,1%. В комплексе эти данные соответствовали разработанным критериям респондерства.

Использование предлагаемого способа позволит до начала лечения выявить различия в синтезе ИФН- и содержании ФНО- и разную их реакцию на первое введение препарата интерферона-, характерные для вирусологической или только для клинико-биохимической ремиссии.

Исследование безопасно, инвазивное вмешательство ограничено двукратным забором крови из вены, доступно для практических учреждений здравоохранения, отсутствуют дополнительные затраты на оборудование и обучение персонала, не трудоемко.

Источники информации

7. Lau D.T.-Y., Comanor L., Minor J.M. et al. Statistical models for predicting a beneficial response to interferon-

12. Вирусный гепатит В. Клиника, диагностика, лечение. – Шеринг-Плау (США). – С.37.

Формула изобретения

Способ прогнозирования эффективности интерферонотерапии при хроническом гепатите В, включающий применение препарата интерферона-, отличающийся тем, что определяют количество ФНО- в сыворотке крови и синтез in vitro ИФН- мононуклеарами (МНК) периферической крови до и через 4,5 часа после введения первой дозы препарата интерферона-, и, при выявлении содержания ФНО- в сыворотке крови до введения, не превышающего 59,31 пг/мл, и повышении после введения интерферона- уровней содержания ФНО- более, чем на 46,1% и синтеза ИФН- МНК более, чем на 70,25% от исходных, прогнозируют вирусологический ответ в ходе 6-месячной интерферонотерапии, а при выявлении содержания ФНО- в сыворотке крови выше 74,51 пг/мл, и повышении после первой инъекции интерферона- уровней содержания ФНО- не более, чем на 24,9%, синтеза ИФН- МНК не более, чем на 70% или снижении обоих цитокинов относительно исходных показателей, прогнозируют отсутствие вирусологического ответа.