Патент на изобретение №2287587

Published by on

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(19)

(11)

2287587

(13)

(51) МПК

C12Q1/68 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Статус: по данным на 28.12.2010 – может прекратить свое действие

(21), (22) Заявка: 2004108882/13, 25.03.2004

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

25.03.2004

(43) Дата публикации заявки: 27.09.2005

(46) Опубликовано: 20.11.2006

(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске:
VAN EIJK V.J.T. et al. “Polymorphism in BoLA-DRB3 exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus”, J Immunol. 1993 Dec 15; 151 (12): 6977-85. WO 9319204, 30.09.1993. US 5582987, 10.12.1996. EP 1113079, 04.07.2001.

Адрес для переписки:

350055, г.Краснодар, пос. Знаменский, СКНИИЖ

(72) Автор(ы):

Ковалюк Наталья Викторовна (RU),
Ковалюк Алексей Анатольевич (RU),
Сивогривов Дмитрий Евгеньевич (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства (СКНИИЖ) (RU)

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области генотипирования КРС, а именно к типированию генотипа крупного рогатого скота по аллелям гена BoLA DRB 3 главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II с целью выявления животных, предрасположенных к персистентному лимфоцитозу. Способ осуществляется следующим образом. Амплифицируется экзон 2 гена BoLA DRB 3 (размер ПЦР-продукта составляет 284 пн), а затем проводится анализ рестрикционного полиморфизма этой области с помощью эндонуклеаз Rsa I, Hae III, BstYI. Если при рестрикции по Rsa I выявляются фрагменты 141, 54-51, 39 пн, амплификат необходимо обработать также рестриктазой Bst 2U I. В этом случае аллельный вариант BoLA DRB 3*7 образует фрагменты 24, 57, 89 и 111 пн; аллельный вариант BoLA DRB 3*8 – 24, 80 и 180 пн; аллельный вариант BoLA DRB 3*9 – 24, 57 и 203 пн. Таким образом, можно безошибочно дифференцировать аллели BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB 3*9. Изобретение позволяет выявлять животных с аллелем BoLA DRB 3*8, которые чувствительны к лейкозу. Изобретение может быть использовано в животноводстве. 3 табл.

Изобретение относится к области генотипирования КРС, а именно к тонированию генотипа крупного рогатого скота по аллелям BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB 3*9 гена BoLA DRB3 главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II с целью выявления животных, предрасположенных к персистентному лимфоцитозу.

Молекулы МНС класса II располагаются в основном на клетках, имеющих отношение к иммунным ответам. Вероятно, содержащие вирусные частицы клетки связываются с гликопротеинами MHC класса II на поверхности антиген-представляющих клеток и благодаря этому активируют Т-лимфоциты, уничтожающие комплекс (вирус-содержащая клетка + антиген-представляющая клетка) (1).

На основе длительных наблюдений, проведенных в различных странах на многотысячном поголовье крупного рогатого скота, было выявлено более частое проявление лейкоза в потомстве одних и тех же быков, что подтверждает наследственный характер заболевания лейкозом.

Гены МНС класса II крупного рогатого скота экспрессируются с различной интенсивностью. Уровень экспрессии гена BoLA DRB 3 – один из самых высоких (5).

М.J.Т. Van Eijk, J.A. Stewart-Haynes, J.E. Beever (1992); Г.Е.Сулимова, И.Г.Удина, Г.О.Шайхаев, И.А.Захаров (1995); М. Zanotti et al. (1996); С.П.Павленко (2000); И. Г. Удина и др. (2000) отмечают связь между определенными аллелями гена BoLA DRB 3 главного комплекса гистосовместимости и восприимчивостью к лейкозу.

Наиболее близким к предлагаемому является способ идентификации аллелей гена BoLA DRB 3 (6), заключающийся в амплификации экзона 2 гена BoLA DRB 3 (размер ПЦР-продукта составляет 284 пн), проведении анализа рестрикционного полиморфизма этой области с помощью эндонуклеаз RsaI, Hae III, BstYI. Для разных аллельных вариантов гена характерно образование после рестрикции продуктов амплификации наборов рестриктных фрагментов (ДНК-паттернов) (табл.1).

Сопоставление ДНК-паттернов, полученных с использованием указанных выше рестриктаз, позволяет идентифицировать 30 аллелей гена BoLA DRB 3 (табл.2).

Таблица 1 ДНК-паттерны и соответствующие им фрагменты рестрикции
RsaI-паттерны		BstYI-паттерны		HaeIII-паттерны
Название	Величина фрагментов рестрикции, пн	Название	Величина фрагментов рестрикции, пн	Название	Величина фрагментов рестрикции, пн
а	78, 54, 50, 39, 33, 30	a	199, 85	а	167, 65, 52
b	111, 54, 50, 39, 30	b	284	b	219, 65
с	111, 93, 50, 30	с	196, 85	с	167, 65, 49
d	143, 111, 30	d	97, 87	d	190, 65, 29
е	141, 51, 50, 39	е	112, 87, 85	е	167, 117
f	141, 54, 50, 39	f	281	f	167, 65, 48
g	141, 104, 39
h	111, 69, 54, 50
i	180, 54, 50
j	78, 93, 63, 50
k	156, 78, 50
u	234, 50
m	111, 104, 69
n	180, 104
o	284
p	111, 51, 50, 39, 30
q	141, 90, 50
r	111, 90, 50, 30
s	141, 93, 50
t	78, 69, 54, 50, 33
u	153, 78, 50

Таблица 2 Таблица определения аллелей гена BoLA DRB 3 на основе данных рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз RsaI, Hae III, BstYI и их связь с устойчивостью к лейкозу
ПЦР-ПДРФ аллели BoLA DRB3	Название ДНК-паттернов			Отношение к лейкозу*
ПЦР-ПДРФ аллели BoLA DRB3	RsaI	BstY I	Hae III	Отношение к лейкозу*
1	a	a	a	Н
2	b	b	a	Н
3	b	b	b	Н
4	с	a	a	Н
5	r	с	с	Н
6	d	a	a	Н
7	e	с	с	Н
8	f	a	a	Ч
9	f	d	a	Н
10	f	b	a	Н
11	g	e	a	P
12	h	a	a	Н
13	h	b	a	Н
14	h	b	b	Н
15	i	b	a	Н
16	j	b	d	Ч
17	k	b	b	Н
18	l	b	f	Н
19	s	b	b	Н
20	l	b	b	Н
21	l	b	e	Н
22	m	b	a	Ч
23	n	b	a	Р
24	n	b	b	Ч
25	o	a	a	Н
26	o	a	b	Н
27	o	b	f	Н
28	o	b	b	Р
29	p	с	с	Н
30	q	с	с	Н
*Примечание: Статус аллелей по отношению к лейкозу: аллели, обуславливающие чувствительность (Ч), устойчивость (Р) и нейтральные (Н), влияние которых на восприимчивость или устойчивость к лейкозу не было отмечено.

Допустим, при рестрикции ПЦР-продукта эндонуклеазой RsaI образуются фрагменты 141, 104 и 39 пн (по табл.1 находим, что это RsaI-паттерн g); эндонуклеазой BstYI – 112, 87, 85 пн (BstYI-паттерн е); эндонуклеазой HaeIII – 167, 65, 52 (HaeIII-паттерн а). Затем по табл.2 определяем, какой аллели соответствует комбинация установленных ДНК-паттернов.

Комбинация RsaI-паттерна g, BstYI-паттерна е и HaeIII-паттерна а соответствует 11 аллели гена BoLA DRB 3. Как видно из табл.2, эта аллель определяет устойчивость к лейкозу.

Очевидным недостатком подобного анализа является сложность диффреренцировки аллелей BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB 3*9 (например, RsaI-паттерн е отличается от RsaI-паттерна f длиной одного фрагмента на 3 пн; BstYI-патерн а от BstYI-паттерна с – на 3 пн), а это имеет принципиальное значение, так как аллель BoLA DRB 3* 8 обуславливает предрасположенность к лейкозу, а аллели BoLA DRB З* 7 и BoLA DRB 3*9 в такой связи не отмечены. При применении подхода, описанного выше, возможен достаточно высокий процент неверно интерпретированных генотипов, особенно учитывая то, что частота встречаемости аллелей BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB 3*9 достигает в некоторых популяциях 20%.

Задача изобретения – повышение точности определения генотипа крупного рогатого скота путем дифференциации аллелей BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB 3*9.

Задача решается тем, что в способе определения генотипа КРС, включающем проведение полимеразной цепной реакции для амплификации участка гена BoLA DRB 3, анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции, помимо эндонуклеаз RsaI, HaeIII, BstYI дополнительно используется эндонуклеаза Bst 2U I при дифференциации аллелей BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB 3*9.

Способ осуществляется следующим образом. Амплифицируется экзон 2 гена BoLA DRB 3 (размер ПЦР-продукта составляет 284 пн), а затем проводится анализ рестрикционного полиморфизма этой области с помощью эндонуклеаз RsaI, Hae III, BstYI. Если при рестрикции по RsaI выявляются фрагменты 141, 54-51, 39 пн, амплификат необходимо обработать также рестриктазой Bst 2U I. В этом случае аллельный вариант BoLA DRB 3*7 образует фрагменты 24, 57, 89 и 111 пн; аллельный вариант BoLA DRB 3*8 – 24, 80 и 180 пн; аллельный вариант BoLA DRB 3*9 – 24, 57 и 203 пн. Таким образом можно безошибочно дифференцировать аллели BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB3*9 (табл.3).

Таблица 3
Аллель	Контроль*	Предлагаемый способ
BoLA DRB 3	Величина фрагментов после рестрикции по RsaI, пн	Величина фрагментов после рестрикции по Bst 2U I., пн
BoLA DRB 3*7	141, 51, 50, 39	111, 89, 57, 24
BoLA DRB 3*8	141, 54, 50, 39	180, 80, 24
BoLA DRB 3*9	141, 54, 50, 39	203, 57, 24
*B качестве контроля использовался способ по прототипу (6).

¹⁾Нуклеотидная последовательность аллели BoLA DRB 3*7 следующая:

Таким образом, в предлагаемом способе величина фрагментов после рестрикции позволяет безошибочно дифференцировать аллели BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB3*9 при определении генотипа крупного рогатого скота.

Источники информации

1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1987. – 1050 с.

Формула изобретения

Способ дифференциации аллелей гена BoLA DRB 3 крупного рогатого скота, включающий проведение полимеразной цепной реакции для амплификации участка гена BoLA DRB 3, анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции с использованием эндонуклеазы, отличающийся тем, что при дифференциации аллелей дополнительно использован фрагмент Bst 2UI, расщепляющий амплификат с аллели BoLA DRB 3*7 на фрагменты 111, 89, 57, 24 пн; с аллели BoLA DRB 3*8 – на 180, 80, 24 пн; с аллели BoLA DRB 3*9 – на 203, 57, 27 пн, по которым проводят дифференциацию аллелей BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8, BoLA DRB 3*9, что позволяет выявить животных, чувствительных к лейкозу, с аллелью BoLA DRB 3*8, имеющую длины рестрикционных фрагментов – 180, 80, 24 пн.

RH4A – Выдача дубликата патента Российской Федерации на изобретение

Дата выдачи дубликата: 30.04.2009

Наименование лица, которому выдан дубликат:

Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства (СКНИИЖ) (RU)

Извещение опубликовано: 10.06.2009 БИ: 16/2009