Патент на изобретение №2287570

(54) ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА PENICILLIUM FUNICULOSUM – ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ, КСИЛАНАЗЫ, ПЕКТИНАЗЫ И МАННАНАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Штамм мицелиального гриба Penicillium funiculosum BKM F-3668D получают с помощью многоступенчатого классического мутагенеза и селекции из исходной культуры Penicillium funiculosum P1 (BKM F-3661D) с применением ультрафиолетового облучения. Штамм обладает способностью продуцировать комплекс высокоактивных карбогидраз, включающий целлюлазы, -глюканазы, ксиланазы, пектиназы, и маннаназы, что создает возможность получения намного более активного и полного комплекса ферментов, а также, при необходимости – отдельных индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса. Для получения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред, могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов. Изобретение позволяет существенно увеличить эффективность и расширить спектр использования ферментных препаратов в различных областях биотехнологии и, особенно, в качестве кормовых добавок.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности и в сельском хозяйстве. Мультиферментные комплексы карбогидраз, содержащие -глюканолитические, целлюлозо- и гемицеллюлозолитические ферменты, лизирующие основные компоненты клеточной стенки, как и отдельные карбогидразы, могут применяться для биодеградации целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих субстратов, в том числе отходов промышленности и сельского хозяйства, для биодеградации клеточных стенок растений, а также в пищевой и спиртовой промышленности, в пивоварении, в качестве добавок в кормах, для силосования кормов в сельском хозяйстве.

Известно достаточно много штаммов-продуцентов отдельных карбогидраз, главным образом, целлюлаз и способы их культивирования в аэробных условиях.

Обычно микроорганизмы, в частности мицелиальные грибы, образуют комплекс ферментов, разрушающих растительные субстраты. Как правило, комплекс включает преимущественно целлюлазы, а также другие карбогидразы, среди которых чаще всего встречаются ксиланазы, -глюканазы и пектиназы.

Выбор штамма-продуцента определяется его способностью обеспечить достаточно высокие уровни активности карбогидраз в ферментационной среде, скоростью образования ферментов, выходом ферментов с единицы массы используемого субстрата, а также стоимостью самих субстратов.

Известны штаммы Aspergillus niger, при культивировании которых на средах с индукторами целлюлозолитических ферментов получают комплекс ферментов, включающих целлюлазу, ксиланазу, -глюкозидазу, -ксилозидазу, -глюканазу и ламинариназу (Патент РФ N 2057179, кл. C 12 N 9/42, 1996 г.). Активности ферментов в культуральной жидкости составляют, соответственно: целлюлазы – 5,0 Е/мл; ксиланазы – 125,0 Е/мл; -глюкозидазы – 20,0 Е/мл; -ксилозидазы – 36,0 Е/мл; -глюканазы – 0,95 Е/мл и ламинариназы – 1,25 Е/мл. Хотя грибы рода Aspergillus образуют комплексы с широким спектром карбогидраз, однако активность большинства отдельных компонентов комплекса недостаточно высокая, что часто делает нецелесообразным их практическое применение.

Активными продуцентами целлюлаз являются штаммы мицелиальных грибов рода Trichoderma (Патент США N 4472504, кл. C 12 N 9/42, 1984 г., патент ГДР N 291673, кл. C 12 N 9/42, 1991 г.). Грибы рода Trichoderma, как правило, обладают высокой продуктивностью в отношении целлюлаз, но в гораздо меньшей степени – в отношении других карбогидраз (-глюканаз, ксиланаз, пектиназ, маннаназ), необходимых для гидролиза различных полисахаридов, входящих (помимо целлюлозы) в состав растительного сырья.

Известен мутант Trichoderma reesei ВСМ 18.2/КК (ВГНКИ-28), полученный с помощью парасексульных процессов из исходной культуры Trichoderma reesei IMET 43803, который обладает повышенной продуктивностью и позволяет при одностадийной ферментации обеспечить высокую активность ферментов (целлюлаз) с единицы массы используемого субстрата (Патент РФ № 2001949, C 12 N 9/42, 1993 г.). Штамм 18.2/КК имеет ферментные системы, позволяющие расти на среде с целлюлозой, крахмалом, хитином, пектином, ксиланом, ламинарином, лихенином. При культивировании на жидкой питательной среде на основе свекловичного жома достигается уровень активности в 3,5-4,2 ед/мл FPA (время культивирования 110 ч), при культивировании в ферментере на среде с лактозой – 18.2 ед/мл (81 ч), при культивировании в ферментере на молочной сыворотке – 12-14 ед/мл (100-110 ч). (FPA – активность целлюлазного комплекса, определенная по фильтровальной бумаге и выраженная в международных единицах согласно рекомендации IUPAC (T.K.Chose., Pure and Appl. Chem, vol.59, №2, pp.257-268).

Ранее нами был получен с помощью многоступенчатого классического мутагенеза и селекции из исходной культуры Trichodrema reesei QM 6а мутант Trichoderma longibrachiatum TW-1 (BKM F-3634 D), (заявка на выдачу патента РФ № 2001105482/13 от 28.02.2001 г.), который при культивировании в жидкой среде на основе микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) и лактозы (время культивирования 120 ч) обеспечивает активность целлюлаз, -глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ, соответственно: 6,0; 30,2; 22,0; 7,5 и 1,2 ед/мл культуральной жидкости; при культивировании в ферментере на среде с пшеничными отрубями, гидролизатом крахмала и МКЦ – 20,0; 380,0; 65,0; 23,0 и 24,0 ед/мл, соответственно (время культивирования 120 ч).

Способностью продуцировать комплекс карбогидраз обладают также грибы рода Penicillium. В литературе описан мутант Penicillium funiculosum Cu-1, который на средах с целлюлозой, пшеничными или рисовыми отрубями образует целлюлазы – 2.6-3.3 ед/мл FPA, -глюкозидазу – 3,0-7,5 ед/мл и ксиланазу – 33-36 ед/мл. (Enzyme Microb. Technol., 1986, vol.8, p.p.105-108).

Имеются сведения о продукции комплекса карбогидраз с широким спектром активностей (целлюлозолитической, гемицеллюлозолитической, глюканолитической, амилолитической, пектинолитической и протеолитической) грибами Penicillium janthinellum V39/S (DE Patent № 4243423, 01.07.93). Сведения о величине активностей отсутствуют.

Известен мутант Penicillium occitanis Pol6, обладающий достаточно высокой продуктивностью широкого спектра карбогидраз на средах с чистой целлюлозой или в комбинации с пшеничными отрубями, свекловичным жомом или ксиланом (Enzyme Microb. Technol., 1990, vol.12, p.p.691-696).При культивировании в жидких питательных средах в зависимости от субстрата или источника углерода штамм Penicillium occitanis Pol6 образует комплекс карбогидраз, содержащий целлюлазы, ксиланазы, пектиназы, маннаназы, -глюкозидазу, ламинариназуы с активностями – 4,8-5,7 (FPA); 175-258; 52,3; 29,0; 17,0; 139,0 ед/мл, соответственно.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, – расширение арсенала высокопродуктивных штаммов-продуцентов мультиферментного комплекса, содержащего широкий спектр карбогидраз.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в получении нового штамма-продуцента комплекса с более высоким уровнем активностей как целлюлаз, так и других компонентов комплекса – -глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ.

Сущность объекта изобретения – новый специально селекционированный штамм мицелиального гриба Penicillium funiculosum BKM F-3668 D продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, -глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы.

Штамм мицелиального гриба Penicillium funiculosum депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ F-3668D.

Штамм получают с помощью многоступенчатого классического мутагенеза и селекции из исходной культуры Penicillium funiculosum P1 (ВКМ F-3661D). Суспензию спор исходного штамма облучают ультрафиолетом. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), культивируют при 28°С в течение 2 суток и проводят окрашивание Конго Красным. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза целлюлаз, -глюканаз, ксиланаз, пектиназ и манананаз при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах наиболее активные варианты снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше.

Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4°С с обязательным пересевом не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.

Культурально-морфологические признаки штамма.

При росте на Мальц-агаре (25°С) диаметр колоний достигает 36 мм на 7 сутки роста. Колонии плотные, ровные с выпуклым центром. Мицелий светлый, пушистый. Обратная сторона палево-красновато-оранжевая. Конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом на 7-ые сутки имеют 27-30 мм в диаметре, складчатые, с ровным краем, поверхность шерстистая. Мицелий светлый, желтоватый. Обратная сторона палево-оранжевая. Конидиогенез слабый, светлый, желтоватый. Обратная – сторона палево-оранжевая. Конидиогенез слабый.

Гриб не растет на среде с глицерином и на агаре Чапека при 5°С. При культивировании на агаре Чапека при 37°С колонии имеют 18 мм в диаметре, складчатые, средней плотности, обратная сторона буровато-красноватая.

Конидиогенез: кисточки бивертициллятные, метулы прижатые, гладкие (8-10×2,5-3,0). Фиалиды ацерозные (8-9×2,5-3,0), с короткой шейкой. Конидии эллиптические, мелкие (2,2×1,5-2,0), гладкие.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляет 0,35 ч^-1, в конце культивирования 0,1 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма.

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом не наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз. Резистентность к нистатину хорошая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен быстро ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннозу, D-маннит, трегалозу, сорбозу и сорбит, медленнее – D-ксилозу, L- и D-арабинозу, L-рамнозу и рибозу. Слабо ассимилирует: D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу и 5-тио-D-глюкозу.

Использует неорганический и органический азот, хорошо ассимулирует нитратную и аммонийную форму азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, -глюкане, лихенине, пектине, и галактоманнане. Способен утилизировать молочную кислоту при концентрации ниже ингибирующей.

Катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз значительно снижена. Проверка катаболитной репрессии биосинтеза карбогидраз заключается в следующем. Конидии пересевают в пробирки с минимальной средой, содержащей минеральные соли, следовое количество (0,5 г/л) дрожжевого экстракта, аморфную целлюлозу, а также исследуемый репрессор или антиметаболит (глюкоза, 2-дезокси-D-глюкоза, лактоза, глицерин и др.). Диаметр пробирки – 9 мм, высота столбика агара 50-60 мм. Пробирку инкубируют 4 суток при 30°С и затем 20 ч при 45°С. Об устойчивости биосинтеза карбогидраз к катаболитной репрессии судят по глубине зоны деструкции аморфной целлюлозы (по размеру зоны просветления столбика агара в пробирке) в присутствии репрессора или антиметаболита.

Полученный мутант Penicillium funiculosum № ВКМ F-3668D по своим морфологическим признакам при росте на глюкозокартофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма Penicillium funiculosum P1 существенно сниженной интенсивностью спороношения, цветом пигмента спор и окраской колонии (серозеленоватого оттенка) с обратной стороны при выращивании на агаризованных средах, более медленным ростом на твердых средах, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу целлюлаз и других, кроме целлюлаз, карбогидраз -глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения».

Культивирование штамма Penicillium funiculosum BKM F-3668D проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии на питательной среде, содержащей один или несколько субстратов источников углерода, являющихся индукторами биосинтеза ферментов. В качестве субстратов могут использоваться и субстраты, не являющиеся непосредственно индукторами. Штамм способен в соответствующих условиях проведения процесса культивирования на основе использования нерастворимых (МКЦ) и растворимых (глюкоза) субстратов секретировать в культуральную среду комплекс ферментов – карбогидраз (целлюлаз, -глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ). Глюкоза в среде культивирования может быть заменена более дешевым продуктом – гидролизатом крахмала.

Активность целлюлаз определяют по FPA (согласно рекомендации ШРАС), активность -глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ в культуральной жидкости определяют по способности расщеплять -глюкан, ксилан, полигалактуроновую кислоту и галактоманнан, соответственно. За единицу активности принимают такое количество ферментов, которое в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 5,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или в виде сухих препаратов.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Для получения посевного материала (инокулята) культуру гриба Penicillium funiculosum BKM F-3668D выращивают на сусло- или СМ-агаре при 29°С в течение 7 суток и далее – при комнатной температуре на свету в течение 7 суток. Засев колб проводят 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1% твина 80. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл жидкой среды следующего состава, в г/л: глюкоза – 20,0; МКЦ – 20,0; кукурузный экстракт – 10; (NHO₂SO₄ – 5,0; КН₂PO₄ – 3,0; MgSO₄×7H₂O – 0,3; рН 4,5. Колбы инкубируют на качалке при 30°С и 200 об/мин, в течение 144 ч.

Активность целлюлаз, -глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 12,0; 150,0; 180,0; 10,0 и 8,0 ед/мл, соответственно.

Пример 2. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) – 40,0; пшеничные отруби – 10,0; дрожжевой экстракт – 10,0; (NH₄)₂SO₄ – 5,0; КН₂PO₄ – 5,0; MgSO₄×7H₂O – 0,3; CaCl₂×2H₂O – 0,3; рН 4,5.

Активность целлюлаз, -глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет на 144 ч культивирования 18,0; 310,0; 420,0; 20,0 и 15,0 ед/мл, соответственно.

Пример 3. Проводят процесс культивирования в ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6,0 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Ферментер инокулируют 500 мл вегетативного мицелия, полученного через 36 ч культивирования на качалочных колбах Эрленмейера, содержащих жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: глюкоза – 14,0; дрожжевой экстракт – 10,0; КН₂PO₄ – 10,0; MgSO₄×7H₂O – 0,3; CaCl₂ – 0,2; (NH₄)SO₄ – 5,0; рН 4,5.

Первую фазу культивирования (на которой гриб главным образом растет и накапливает биомассу) осуществляют в течение 24 ч при 32°С на жидкой питательной среде, имеющей состав как описано в примере 2. Через 24 ч начинают вторую фазу культивирования (на протяжении которой происходит накопление ферментов в среде роста). На второй фазе в ферментер непрерывно добавляют глюкозу так, чтобы ее концентрация в среде не превышала уровня 0,5 г/л. Температуру во второй фазе поддерживают 28°С, а рН 4,0. Ферментация заканчивается через 144 ч, к концу ферментации первоначальный объем среды в ферментере увеличивается за счет вносимого раствора глюкозы на 20% и составляет 7-7,5 л.

Активности целлюлаз, -глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляют на 124-144 ч культивирования 30,0; 550,0; 630,0; 38,0 и 32,0 ед/мл, соответственно.

Пример 4. Процесс проводят в ферментере типа АНКУМ 2М. Режим ферментации тот же, что в примере 3. Культивирование осуществляют на среде состава, приведенного в примере 3, но концентрацию глюкозы и целлюлозы на первой фазе культивирования в составе жидкой питательной среды увеличивают до 40 и 60 г/л соответственно. На второй фазе культивирования добавляют глюкозу также, как в примере 3. В процессе ферментации через 60 ч после ее начала в среду вносят минеральные соли в количестве, которое добавляли в начале процесса культивирования, а через 60 и 96 ч МКЦ в количестве, чтобы ее концентрация была 2 г/л ферментационной среды.

Через 144 ч ферментации активность целлюлаз, -глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 35,0; 820,0; 990,0; 50,0 и 37,0 ед/мл, соответственно.

Таким образом, предлагаемый штамм Penicillium funiculosum ВКМ F 3668D обладает способностью продуцировать комплекс высокоактивных карбогидраз, включающий целлюлазы, -глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы, что создает возможность получения намного более активного и полного комплекса ферментов, а также при необходимости отдельных индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса.

Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов. Препараты, получаемые на основе предлагаемого штамма, позволяют существенно увеличить эффективность и расширить спектр использования ферментных препаратов в различных областях биотехнологии и, особенно, в качестве кормовых добавок.

Формула изобретения

Штамм мицелиального гриба Penicillium funiculosum BKM F-3668D (Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) – продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, -глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы.